3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3. Phản ứng PCR-SSR
Phản ứng PCR-SSR đƣợc thực hiện trên máy PCR với thể tích phản ứng 25µl. Mỗi ống phản ứng PCR-SSR bao gồm các thành phần đƣợc trình bày cụ thể nhƣ trong bảng 2.3.
Mỗi phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau: Biến tính hoàn toàn ở 950C trong 4 phút; lặp lại 33 chu kỳ với: (i) biến tính ở 950
C trong 45 giây, (ii) tiếp hợp mồi ở 470
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
giây, (iii) tổng hợp kéo dài sợi mới ở 720C trong 1 phút; Hoàn thiện các sợi chƣa tổng hợp hết ở 720C trong 9 phút; Bảo quản mẫu ở 40C, thời gian ∞.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR-SSR
TT Thành phần Thể tích (µl)
1 H2O 8
2 PCR Master mix 12,5
3 Primer (Xuôi) (10pmol/µl) 1 4 Primer (Ngƣợc) (10pmol/µl) 1 5 DNA template (25ng/µl) 2,5
Tổng 25
2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Điện di 5µl sản phẩm PCR-SSR trên gel agarose 4% ở 110V trong dung dịch đệm TAE 1X. Gel sau khi điện di đƣợc nhuộm với ethidium bromide trong 15 phút sau đó soi dƣới đèn UV và chụp ảnh.
2.2.5. Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR
Phân tích hệ số tƣơng đồng các giống đƣợc
phƣơng pháp UPGMA trong NTSYS 2.0 theo quy ƣớc: 1 = phân đoạn DNA xuất hiện và 0 = phân đoạn DNA không xuất hiện khi điện di sản phẩm PCR. Xác định hệ số sai khác di truyền và lập biểu đồ hình cây để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương
Sau khi tách chiết và thu đƣợc DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lƣợng DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 30 phút, sau đó nhuộm bằng ethidium bromide 3.1). ảnh điện di
3.1 cho thấy ở tất cả các giếng điện di đều cho một DNA sắc nét, rõ ràng và ít bị đứt gãy
độ tinh sạ sinh học phân tử.
Hình 3.1. điện di DNA tổng số tách từ mầm đậu tương 12 giống đậu tương nghiên cứu
1. DT4; 2. DT8; 3. DT12; 4. DT22; 5. DT26; 6. DT51; 7. DT84; 8. DT96; 9. DT2000; 10. DVN14; 11. NR1; 12. NR2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.2. Kết quả g PCR- SSR
Để phân tích tính đa hình DNA của 12 giống đậu tƣơng nghiên cứ ằng phản ứng PCR- SSR Satt009, Sat_064, Sct_187, Satt460, Satt431, sản phẩm PCR- SSR đƣợc điện di trên gel agarose (4% thang DNA chuẩn 0,5kb. Các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản với
:
Kết quả nhân bản với chỉ thị Satt009
Phản ứng PCR với cặp mồi Satt009-F/ Satt009-R đƣợc sử dụng phân tích hệ gen của 12 giống đậu tƣơng, kết quả nhân bản các phân đoạn DNA đƣợc trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Satt009-F/
Satt009-R
M. 0,5kb; 1. DT4; 2. DT8; 3. DT12; 4. DT22; 5. DT26; 6. DT51;
7. DT84; 8. DT96; 9. DT2000; 10. DVN14; 11. NR1; 12. NR2
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Satt009 cho thấy với cặp mồi Satt009-F/ Satt009-R cho sản phẩm PCR xuất hiện ở các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
giống đậu tƣơng DT8, DT12, DT96, DT2000, DVN14, NR1, NR2. Các băng có kích thƣớc từ 180bp – 210bp, băng có kích thƣớc 180bp là giống NR1, băng có kích thƣớc 190bp gồm các giống DT96, DT2000, DVN14, băng có kích thƣớc 200bp có hai giống là DT8, DT12
có một băng có kích thƣớc lớn nhất là 210bp.
Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Sat_640
Phản ứng PCR với cặp mồi Sat_640 –F/Sat_640-R kết quả nhân bản các phân đoạn DNA ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sat_640 –F
/Sat_640-R
M. 0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5.DT26; 6.DT51;
7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Sat_640 – F/Sat_640-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, NR1, NR2 từ 100bp – 110bp. Băng có kích thƣớc 100bp giống DT22, DT26, DT51,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DT84, băng có kích thƣớc 110bp gồm các giống DT96, DT2000, NR1, NR2.
Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Sct187
Kết quả nhân bản các phân đoạ hản ứng PCR với cặp mồi Sct_187-F/ Sct_ - 12 giống đậu tƣơng, đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. với cặp mồi Sct_187-F
/Sct187-R
M. ; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5.DT26; 6.DT51; 7.DT84;
8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Sct_187-F/ Sct_187-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT4, DT8, DT12, DT22, DT26, DT51, DT96, DT2000, DVN14, NR1 kích thƣớc từ 140bp – 170bp. Băng có kích thƣớc 140bp giống DT4, DT8, DT12, DT22, băng có kích thƣớc 150bp gồm các giống DT26, DT51, DT96, băng có kích thƣớc 170bp có giống là DT2000, DVN14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R
ệ gen của 12 giống đậ hản ứng PCR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R đƣợc ở hình 3.5.
Hình 3.5. với cặp mồi Satt431-F/
Satt431-R
M. 0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5. DT26; 6.DT51;
7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT4, DT8, DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. Các băng có kích thƣớc từ 200bp – 210bp, băng có kích thƣớc 200bp là giống DT4, DT8, băng có kích thƣớc 210bp gồm các giống DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phản ứng PCR với cặp mồi Satt460-F/Satt460-R đ sử dụng phân tích hệ gen của 12 giống đậu tƣơng, kết quả nhân bản các phân đoạn DNA đƣợc trình bày ở hình 3.6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
với cặp mồi Satt460-F /Satt460-R
0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5. DT26; 6.DT51; 7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR cặp mồi Satt460- F/Satt460-R cho thấy có kích thƣớc nhƣ nhau là 100bp xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT12, DT26, DT96, DT2000, DVN14, NR1. 5 chỉ thị SSR đƣợc sử dụng đều cho tính đa hình. Chỉ thị satt009 cho tỷ lệ đa hình cao nhất là 4 loại băng có kích thƣớc khác nhau, chỉ thị Satt460 cho các băng của các giống xuất hiện có kích thƣớc giống nhau. Các băng, vị trí và số phân đoạn của mỗi mồi đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. phân đoạn DNA bằng phản ứng PCR-SRR từ
5 cặp mồi SSR
TT C
SSR
Dạng SSR
Phân đoạn DNA xuất hiện ở các giống đậu tƣơng
iống đậu tƣơng không xuất hiện 1 Satt009 (ATT)14 DT8, DT12, DT96, DNV14, DT2000, NR1, NR2. 5 4 2 Sat_064 (AT)34 DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, NR1, NR2. 4 2 3 Sct_187 (CT)10 DT4, DT8, DT12, DT22, DT26, DT51, DT96, DT2000, DVN14, NR1, NR2. 2 3 4 Satt431 (ATT)21 DT4, DT8, DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. 3 2 5 Satt460 (ATT)24 DT12, DT26, DT98, DT2000, DVN14, NR1. 6 1
Qua phân tích sản phẩm điện di của phản ứng PCR-SSR với 5 cặp mồi đặc hiệu cho đậu tƣơng với 12 giống đậu tƣơng nghiên cứu nhận thấy có 4 chỉ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thị SSR: Satt009, Sat_064, Sct_187, Satt431, Satt460 cho độ đa hình cao chỉ thị Satt460 cho đa hình thấp (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. phân đoạn DNA
khi sử dụng 5 cặp mồi SSR Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản Kích thƣớc Satt009 7 180 bp: NR1. 190bp: DT96, DT2000, DV14. 200bp: DT8, DT12 210bp: NR2 Sat_064 8 100bp: DT22, DT26, DT51, DT84. 110bp: DT96, DT2000, NR1, NR2. Sct_187 10 140bp: DT4, DT8, DT12, DT22. 150bp: DT26, DT51, DT96. 170bp: DT2000, DVN14, NR1. Satt431 9 200bp: DT4, DT8. 210bp: DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. Satt460 6 100bp: DT12, DT26, DT96, DT2000, DVN14, NR1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.2. PHÂN TÍCH TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG
TƢƠNG KHÁNG BỆNH KHÁC NHAU
Sử dụng phần mềm NTSYS version 2.0 trong phân tích tính đa dạng của
12 giống đậu tƣơng dựa trên kết quả
phân tích SSR với 5 , kết quả đã xác định hệ số sai khác di của từng cặp giống đậu tƣơng nghiên cứu ảng 3.3.
3.3. (%) DT4 DT8 DT12 DT22 DT26 DT51 DT84 DT96 DT 2000 DVN 14 NR1 NR2 DT4 0,00 DT8 0,00 0,00 DT12 8,96 8,96 0,00 DT22 1,43 1,43 1,04 0,00 DT26 5,49 5,49 3,47 2,88 0,00 DT51 4,05 4,05 8,96 1,44 1,44 0,00 DT84 8,96 8,96 0,00 3,47 3,47 2,03 0,00 DT96 2,55 2,55 4,58 1,12 1,12 2,55 4,58 0,00 DT2000 2,55 2,55 4,58 1,12 1,12 2,55 4,58 0,00 0,00 DVN14 1,44 1,44 3,47 2,89 2,89 5,49 1,04 1,12 1,12 0,00 NR1 5,49 5,49 3,47 2,89 2,89 5,49 1,04 1,12 1,12 2,89 0,00 NR2 8,96 8,96 0,00 3,47 1,04 8,96 6,93 4,58 4,58 1,04 3,47 0,00
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả bảng 3.3 cho thấy hệ số sai khác di truyền của 12 giống đậu tƣơng giao động trong khoảng 0% đến 8,96%. Trong đó có cặp giống có hệ số sai khác di truyền nhỏ nhất là cặp DT4 và DT8 với hệ số sai khác là 0%. Các cặp có hệ số di truyền cao nhất là DT4 và DT12, DT8 và DT12, DT51 và DT12, DT4 và DT84, DT8 và DT84, NR2 và DT4, NR2 và DT8, NR2 và DT51, hệ số sai khác di truyền đều là 8,96%.
Từ kết quả phân tích sơ đồ hình cây đƣợc thiết lập biểu thị m quan hệ di truyền giữa 12 giống đậu tƣơn
(Hình 3.7)
12 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắ Nhánh thứ nhất Nhánh phụ thứ nhất Nhóm 2 Nhóm 1 Nhóm phụ 1 Nhóm phụ 2 N h á n h t h ứ h a i Nhánh phụ thứ hai
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phân tích sơ đồ hình cây ở hình 3.7 cho thấy 12 giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc chia thành hai nhánh chính, nhánh thứ nhấ ống nhiễm
bệ , bao gồm các
giống kháng bệnh và các giống trung gian và giống nhiễm nhẹ bệnh gỉ sắ khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 60% (1-0,40).
Nhánh thứ hai đƣợc chia làm hai nhánh phụ, nhánh phụ thứ nhất
giống đậ khoảng cách di truyền là
58%. Nhánh phụ thứ hai đƣợc chia làm hai nhóm với khoảng cách di truyền là 52%. Nhóm 1 gồm DT84, DT51, DT26 , nhóm 2 đƣợc chia làm hai nhóm phụ với khoảng cách di truyền là 36%. Nhóm phụ 1 gồm các giống NR1, DVN14, DT2000, DT96 nhóm phụ 2 gồm các giống DT4, DT8, ĐT22. 1, DT2000 ỉ sắt ở mức độ tốt 2, 8 100%,
Sơ đồ hình 3.7 cho thấy các giống đậu tƣơng khác nhau về mặt di truyền phân bố theo khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Nhƣ vậy, cũng giống nhƣ các chỉ thị phân tử khác, kỹ thuật SSR cho phép xác định nhanh mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu tƣơng tham gia thí nghiệm, điều này rất có ý nghĩa kinh tế trong việc chọn tạo giống cây trồng. 5 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng 12 giống đậu tƣơng có phản ứng khác nhau với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bệnh gỉ sắt đều biểu hiện tính đa hình. Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản từ cặp mồi SSR dao động từ 6 đến 10 . Trong 5 cặp mồi có 4 cặp mồi cho tính đa hình cao nhất với hệ số đa dạng di truyền cao. Phân tích đa dạng di truyền trên sơ đồ hình cây cho thấy khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 60%. Những thông tin này là cơ sở cho việc tuyển chọn giống đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt phục vụ sản xuất, đồng thời cũng là cơ sở cho việc lựa chọn cặp bố mẹ khác xa nhau về mặt di truyền phục vụ công tác lai tạo giống.
Để khẳng định một cách chắc chắn nhận định trên cần tiến hành một số các nghiên cứu tiếp theo nhƣ lây nhiễm nhân tạo, thực hiện các phép lai các cá thể bố mẹ thuộc các giống/dòng khác nhau và phân tích theo dõi mức độ phân ly của phân đoạn DNA đặc trƣng ở các thế hệ tiếp theo để đánh giá mức độ liên kết của chỉ thị với tính kháng bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra .
CHUNG
Bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng là một trong những bệnh hại cây đậu đỗ gây thiệt hại năng suất cây trồng và khó phòng trừ tận gốc nguồn bệnh. Bệnh gây ảnh hƣởng đến lá cây, giảm hoạt động quang hợp thực vật, gây rụng lá, chết sớm, và mất năng suất. Mầm bệnh chỉ xuất hiện trên cây trồng và tiêu biến khi cây đậu tƣơng chết hoặc khi nông dân thu hoạch đậu tƣơng. Loại bệnh này xuất hiện tại Mỹ vào năm 2004, chủ yếu ở các bang miền nam. Phun thuốc diệt nấm là cách duy nhất để kiểm soát bệnh vì các nhà khoa học chƣa lai tạo đƣợc giống đậu tƣơng kháng bệnh. Các bào tử gây bệnh gỉ sắt ở đậu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tƣơng Châu Á đang gây mối đe dọa nghiêm trọng đến ngành sản xuất đậu tƣơng của Mỹ do mầm bệnh có thể lây lan qua gió từ khoảng cách rất xa. Các nhà nghiên cứu của trƣờng Đại học Illinois đã tìm ra phƣơng pháp giúp xác định sự xuất hiện của các bào tử này trong môi trƣờng. Các nƣớc trên thế giới và cả Việt Nam đã có rất nhều công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng [1], [4], [7], [18], [37], [38], [41], [43]. Trong nghiên cứu của Vũ Thanh Trà và cộng sự (2006), mƣời một giống đậu tƣơng bao gồm các giống nhập nội nhƣ DT2000 (có khả năng kháng bệnh sắt), DT12, VX92 và VX93 (có năng suất cao), các giống địa phƣơng nhƣ Cúc Vàng, Vàng Mƣờng Khƣơng và CBU8325 (có khả năng chịu sâu, nấm và chịu hạn tốt) và các giống tạo ra từ bằng phƣơng pháp đột biến nhƣ DT84, DT95, M103 và DT96, con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh sắt) đƣợc đánh giá khả năng kháng bệnh sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo bào tử và tạo quầng [17]. Hiện nay vẫn chƣa tìm đƣợc cách hay thuốc bảo vệ thực vật đặc dụng để trừ bệnh gỉ sắt trên đậu tƣơng, vì thế ngƣời dân trồng cây đậu tƣơng chỉ có thể chọn các biện pháp phòng trừ trƣớc khi trồng và sau thu hoạch hạt nhằm hạn chế thiện hại thấp nhất do bệnh gỉ sắt gây ra. Các biện pháp phòng trừ chủ yếu nhƣ: Chọn giống chịu bệnh, chống bệnh và sản xuất giống sạch bệnh để sử dụng trong sản xuất, chọn đúng thời vụ trồng; Luân canh với lúa nƣớc hay các cây hòa thảo; Xử lý giống bằng Bayphidan 10 - 100g a.i./1 tấn hạt giống; Có thể phun thuốc hạn chế bệnh bằng các loại thuốc trừ gỉ sắt đặc biệt nhƣ: Bayleton 250 g a.i./ha; Baycor 125 - 375 g a.i./ha; phun nƣớc lƣu huỳnh vôi 0,3 – 10 Bômê.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bằng sự phát triển mạnh về khoa học kỹ thuật hiện nay có rất nhiều các công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt và gen kháng bệnh gỉ sắt đã đƣợc công bố vào những năm gần đây, để xác định gen kháng bệnh gỉ sắt trên các giống đậu tƣơng của Mỹ và Brazil, sử dụng phƣơng pháp lập bản đồ liên kết chỉ thị phân tử (map-based cloning) các nhà khoa học đã phát hiện có sáu gen chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng bao gồm: Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5, Rpp6 và một số chỉ thị SSR liên kết gần với các gen từ Rpp1 đến Rpp5: Rpp1và Rpp4 thuộc nhóm liên kết G trên NST số 18; Rpp3 thuộc nhóm liên kết C2 trên NST số 6; Rpp3 thuộc nhóm J trên NST số 16 và Rpp5 thuộc nhóm N trên NST số 3 [4], [14], [15], [17], [21], [26], [31], [40].
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu về bệnh gỉ sắt sử dụng các phƣơng