3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1. Chỉ thị hình thái
Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thƣờng đƣợc biểu hiện dƣới dạng một tính trạng đƣợc kiểm soát bởi một locus đơn lẻ nhƣ các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ... Mặc dù chỉ thị hình thái đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong chọn giống gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hƣởng của các nhân tố di truyền nhƣ sự tƣơng tác giữa các sản phẩm của gen. Các nhân tố môi trƣờng nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng có tác động qua lại giữa kiểu gen và kiểu hình, gây ảnh hƣởng không nhỏ đến các giai đoạn phát triển của thực vật.
Biểu hiện khả năng kháng và nhiễm bệnh về mặt hình thái ở thực vật đƣợc xác định theo các tiêu chí nhất định. Đây là chỉ thị quan trọng để tìm kiếm và tạo giống kháng bệnh. Ví dụ nhƣ bệnh gỉ sắt đƣợc xác định trên cơ sở đánh giá vết bệnh trên lá, mức độ tạo quầng, mức độ tạo bào tử, từ đó có thể phân biệt đƣợc các giống đậu tƣơng kháng tốt, kháng trung bình và mẫn cảm với bệnh.
Hơn nữa, một số tính trạng trội đƣợc tạo ra theo ý muốn của con ngƣời thông qua đột biến. Các tác nhân này gây ra một số hiện tƣợng nhƣ lùn, bạch tạng... có hại cho cơ thể của thực vật. Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của các chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hoá sinh học, những khó khăn trên đang từng bƣớc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đƣợc giải quyết [17].
1.3
Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình nhƣ isozymevà các protein dự trữ (stograge protein). Các isozymecó thể đƣợc phân tách theo trọng lƣợng, kích thƣớc phân tử và các chất mang. Nhờ vậy, bằng kỹ thuật điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, ngƣời ta có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ nhƣ isozymeamylase, esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thông tin nhƣ là một loại chỉ thị đồng trội.
Phƣơng pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và đơn giản hơn phân tích DNA. Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen, số lƣợng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định quá trình phát triển của cá thể. Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền.
Hiện nay, kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lƣợng phân tử (chiều thứ hai) . Kỹ thuật này ngày càng trở thành một công cụ đƣợc ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và cơ thể [17].
1.3.3.Chỉ thị phân tử
Kỹ thuật RAPD là phƣơng pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này đƣợc phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [42]. RAPD đã đƣợc sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau. Mồi đƣợc sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD đƣợc phân tách bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen của các đối tƣợng khác nhau hoặc của hai loài sẽ cho sự khác nhau về những phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tƣơng nghiên cứu.
Về nguyên tắc, kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cách sử dụng những mồi ngắn có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các mồi. Mồi (primer) là những đoạn oligonucleotide ngắn, một mạch (khoảng 10 nucleotide) đƣợc tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lƣợng G+C cao (từ 60-70%) và không có đầu tự bổ sung. Các mồi dùng trong RAPD thƣờng ngắn vì vậy dễ dàng tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên mạch đơn DNA của hệ gen. Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc nghiên cứu đa dạng và lập bản đồ di truyền của các locus đặc trƣng bao gồm các bƣớc sau: (i)Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhân bản trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyềnvà thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của các đối tƣơng nghiên cứu. Các sinh vật cùng loài có kiểu gen hoàn toàn giống nhau thì các đoạn DNA đƣợc khuếch đại sẽ có kích thƣớc giống nhau, khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD. Với các sinh vật khác loài, khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD, các đoạn DNA đƣợc khuếch đại sẽ có kích thƣớc khác nhau. Để tìm sự khác biệt giữa các loài, ngƣời ta thƣờng sử dụng các mồi ngẫu nhiên với số lƣợng lớn.
Kỹ thuật RAPD đƣợc ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến một tính trạng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hoặc thiết lập bản đồ di truyền. Có rất nghiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện trên thế giới và Việt Nam sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học nhƣ ở Brazil về nghiên cứu trên đối tƣợng ngô, ở Hy Lạp trên đối tƣợng chè, ở Việt Nam trên nhiều đối tƣợng cây trồng [12], [13], [19].
Chỉ thị SSR
Kỹ thuật SSR do Litt và Luty (1989) [28], phát hiện lần đâu tiên ngƣời. SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đó. Hiện tƣợng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lƣợng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lƣợng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn. Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide nhƣ (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật. Phƣơng thức lặp lại đƣợc phân thành 3 loại chính: lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau).
Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus đặc trƣng bao gồm các bƣớc sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thƣ viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trƣng là các trình tự DNA bảo thủ giới hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhân vùng gen tƣơng ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trƣng; (v) Phân tích kích thƣớc của sản phẩm PCR nhằm xác định đƣợc sự có mặt của các alen SSR.
SSR là công cụ hữu ích của phân tích hệ gen, lập bản đồ gen và đặc biệt là chọn giống phân tử vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Song nhƣợc điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ đặc trƣng cho một loài nhất định [25], [31], [33].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Trong thực tế, chỉ thị này đã đƣợc sử dụng trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ đa hình các alen thuộc cùng một locus.
Các DNA vi vệ tinh hay các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeats – SSRs) có mặt khắp nơi trong hệ gen của sinh vật nhân thực. Trong thập kỷ qua, các chỉ thị này đã đƣợc nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách di truyền, ƣớc tính dòng chảy gen và xây dựng bản đồ liên kết [33], [40]. Mặc dù các chỉ thị SSR có tính ƣu việt rất lớn trong việc nghiên cứu di truyền hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, xác định khoảng cách di truyền và xây dựng bản đồ liên kết… Tuy nhiên, cho đến nay chỉ có một số lƣợng rất ít các công trình nghiên cứu công bố về một số lƣợng không lớn các chỉ thị SSR trong nghiên cứu genome đậu tƣơng. Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình.
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR đƣợc áp dụng để nghiên cứu đa dạng trên cả đối tƣợng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và đáng tin cậy. Ở thực vật, tần số và số lƣợng SSR đã đƣợc xác định trên một số loài nhƣ lạc, mơ, lúa mì [10], [12], [16], và đang phát triển ở các giống cây trồng khác nhƣ đậu tƣơng [17]. Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liên quan đến một số tính trạng đã đƣợc xác định nhƣ chọn giống nhờ chỉ thị (marker-assistedselection). Chọn các dòng lúa có năng suất cao và hàm lƣợng protein dự trữ cao hoặc để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống cây trồng ở một số đối tƣợng nhƣ: lúa, mía, đậu tƣơng hay xác định giới tính thực vật trên đối tƣợng đu đủ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các chỉ thị RFLP và AFLP
Các chỉ thị phân tử nhƣ RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa hình DNA.
Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu. Kỹ thuật RFLP đƣợc tiến hành nhƣ sau: các endonuclease cắt giới hạn đƣợc sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trình tự nhận biết đặc trƣng, tạo ra hàng loạt các phân đoạn nhỏ có kích thƣớc khác nhau. Số lƣợng các phân đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ gen. Sản phẩm của quá trình cắt sẽ đƣợc điện di, sau đó đƣợc chuyển nguyên vị và cố định trên màng lai. Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn sẽ đƣợc phát hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dò đã đƣợc đánh dấu (bằng phóng xạ hoặc bằng phƣơng pháp hoá học) và các đoạn DNA của mẫu cần phân tích (đƣợc tạo ra từ cùng một locus theo nguyên tắc bổ sung).
Trong khi đó, AFLP là một kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân các đoạn đƣợc cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn. Cũng nhƣ các chỉ thị phân tử khác, AFLP khám phá hiện tƣợng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn DNA đƣợc nhân. Kỹ thuật này gồm 3 bƣớc: cắt DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter), nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA đƣợc nhân lên. Chỉ thị AFLP ít phức tạp hơn RFLP, với ƣu điểm là độ đa hình cao nhận dạng tới cá thể, thông qua đó có thể tìm đƣợc những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [39].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dụng chỉ thị RAPD đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp. Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tƣơng đã và đang đƣợc một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [20]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng còn rất hạn chế, đặc biệt là trên đối tƣợng đậu tƣơng có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt. Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực và cây thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu giống đậu tƣơng nhập nội và giống đậu tƣơng địa phƣơng đã đƣợc đánh giá về khả năng chịu nóng, chịu hạn, kháng sâu bệnh. Việc chọn tạo giống chủ yếu dựa trên những phƣơng pháp thủ công truyền thống trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, nông sinh học mà chƣa đi sâu vào chọn lọc dựa trên những đặc điểm di truyền phân tử. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống đậu tƣơng là rất cần thiết [17].