3. Nội dung nghiên cứu
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số đƣợc tách chiết từ mầm đậu tƣơng, mầm hạt đƣợc chuẩn bị bằng cách ngâm hạt khô trong nƣớc cất 1 giờ, cho hạt nẩy mầm trên giấy lọc trong hộp lồng ở buồng tối, khi mầm dài khoảng 2cm, tách riêng lấy phần thân mầm rồi bảo quản trong tủ lạnh sâu (- 200C).
:
(1) Nghiền 0,5g mầm với nitro lỏng bằng cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung 4ml đệm rửa (Tris-HCl 100mM, pH8; EDTA 5mM, pH8; NaH2PO4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
0,4%; Sobitol 350 mM; H2O), nghiền tiếp đến khi trở thành dung dịch đồng nhất. Chia hỗn hợp dung dịch vào đầy 2 ống eppedorf loại 1,5ml. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch (lặp lại 1 lần nữa thao tác này).
(2) Bổ sung vào 700µl đệm chiết (Tris-HCl 100mM, pH8; EDTA 20mM, pH8; CTAB 4%; NaCl 1,4M; H2O) vào mỗi ống eppendorf chứa mẫu. Ủ mẫu ở 650C trong vòng 45 phút, khoảng 10 phút đảo ngƣợc ống eppendorf 2 – 3 lần. Ủ xong để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(3) Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
(4) Bổ sung Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lƣợng dung dịch mẫu, đảo ống 2 – 3 lần. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch pha trên, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lƣợng dung dịch mẫu, đảo ống 2-3 lần. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch pha trên, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
(5) Bổ sung Isopropanol với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lƣợng dung dịch mẫu, bảo quản ở -200C trong vòng 2 giờ. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch.(6) Bổ sung 500 µl ethanol 70%, mix nhẹ bằng tay. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch, để khô. Bổ sung 45 µl nƣớc khử ion, bảo quản mẫu DNA ở -200
C.
2.2.2. Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích mẫu
Tuyển chọn các chỉ thị SSR
(2012) [17] chúng tôi đã chọn và sử dụng 5 SSR cho việc phân tích đa dạng di truyền của các giống đậu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tƣơng. Năm cặp mồi sử dụng trong các phản ứng PCR-SSR nghiên cứu đƣợc đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự các cặp mồi đƣợc trình bày trong bảng 2.2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
Tên cặp mồi
Trình tự mồi xuôi (F) và mồi ngƣợc (R) từ đầu 5’ – 3' Tm Tan thực tế Kích thƣớc (bp) Kiểu base Satt009
F CCA ACT TGA AAT TAC TAG AGA AA 51,3
46 163 (ATT)14
R CTT ACT AGC GTA TTA ACC CTT 49,0
Sat_064
F GTA TGC AAGG GATT AATT AAG 56,0
54 146 (AT)34
R TAG CTT TAT AAT GAG TGT GAT AGA T 64,0
Sct_187
F CT TG CT CCC ATT CT CT 48,0
46 136 (CT)10
R AAC ATT GGC TTT TTA CTT AG 52,0
Satt431
F GCG TGG CAC CCT TGA TAA ATA A 61,8
58 230 (ATT)21
R GCG CAC GAA AGT TTT TCT GTA ACA 63,3
Satt460
F GCG CGA TGG GCT GTT GGT TTTNTAT 73,9
58 156 (ATT)24
R GCG CTA ACG ATTT GGCA TTTTT CTA TTG 73,5
* Tm: Nhiệt độ mồi bắt cặp theo lý thuyết; Tan: Nhiệt độ mồi bắt cặp trên thực tế
2.2.3. Phản ứng PCR-SSR
Phản ứng PCR-SSR đƣợc thực hiện trên máy PCR với thể tích phản ứng 25µl. Mỗi ống phản ứng PCR-SSR bao gồm các thành phần đƣợc trình bày cụ thể nhƣ trong bảng 2.3.
Mỗi phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau: Biến tính hoàn toàn ở 950C trong 4 phút; lặp lại 33 chu kỳ với: (i) biến tính ở 950
C trong 45 giây, (ii) tiếp hợp mồi ở 470
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
giây, (iii) tổng hợp kéo dài sợi mới ở 720C trong 1 phút; Hoàn thiện các sợi chƣa tổng hợp hết ở 720C trong 9 phút; Bảo quản mẫu ở 40C, thời gian ∞.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR-SSR
TT Thành phần Thể tích (µl)
1 H2O 8
2 PCR Master mix 12,5
3 Primer (Xuôi) (10pmol/µl) 1 4 Primer (Ngƣợc) (10pmol/µl) 1 5 DNA template (25ng/µl) 2,5
Tổng 25
2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Điện di 5µl sản phẩm PCR-SSR trên gel agarose 4% ở 110V trong dung dịch đệm TAE 1X. Gel sau khi điện di đƣợc nhuộm với ethidium bromide trong 15 phút sau đó soi dƣới đèn UV và chụp ảnh.
2.2.5. Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR
Phân tích hệ số tƣơng đồng các giống đƣợc
phƣơng pháp UPGMA trong NTSYS 2.0 theo quy ƣớc: 1 = phân đoạn DNA xuất hiện và 0 = phân đoạn DNA không xuất hiện khi điện di sản phẩm PCR. Xác định hệ số sai khác di truyền và lập biểu đồ hình cây để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương
Sau khi tách chiết và thu đƣợc DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lƣợng DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 30 phút, sau đó nhuộm bằng ethidium bromide 3.1). ảnh điện di
3.1 cho thấy ở tất cả các giếng điện di đều cho một DNA sắc nét, rõ ràng và ít bị đứt gãy
độ tinh sạ sinh học phân tử.
Hình 3.1. điện di DNA tổng số tách từ mầm đậu tương 12 giống đậu tương nghiên cứu
1. DT4; 2. DT8; 3. DT12; 4. DT22; 5. DT26; 6. DT51; 7. DT84; 8. DT96; 9. DT2000; 10. DVN14; 11. NR1; 12. NR2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.2. Kết quả g PCR- SSR
Để phân tích tính đa hình DNA của 12 giống đậu tƣơng nghiên cứ ằng phản ứng PCR- SSR Satt009, Sat_064, Sct_187, Satt460, Satt431, sản phẩm PCR- SSR đƣợc điện di trên gel agarose (4% thang DNA chuẩn 0,5kb. Các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản với
:
Kết quả nhân bản với chỉ thị Satt009
Phản ứng PCR với cặp mồi Satt009-F/ Satt009-R đƣợc sử dụng phân tích hệ gen của 12 giống đậu tƣơng, kết quả nhân bản các phân đoạn DNA đƣợc trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Satt009-F/
Satt009-R
M. 0,5kb; 1. DT4; 2. DT8; 3. DT12; 4. DT22; 5. DT26; 6. DT51;
7. DT84; 8. DT96; 9. DT2000; 10. DVN14; 11. NR1; 12. NR2
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Satt009 cho thấy với cặp mồi Satt009-F/ Satt009-R cho sản phẩm PCR xuất hiện ở các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
giống đậu tƣơng DT8, DT12, DT96, DT2000, DVN14, NR1, NR2. Các băng có kích thƣớc từ 180bp – 210bp, băng có kích thƣớc 180bp là giống NR1, băng có kích thƣớc 190bp gồm các giống DT96, DT2000, DVN14, băng có kích thƣớc 200bp có hai giống là DT8, DT12
có một băng có kích thƣớc lớn nhất là 210bp.
Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Sat_640
Phản ứng PCR với cặp mồi Sat_640 –F/Sat_640-R kết quả nhân bản các phân đoạn DNA ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sat_640 –F
/Sat_640-R
M. 0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5.DT26; 6.DT51;
7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Sat_640 – F/Sat_640-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, NR1, NR2 từ 100bp – 110bp. Băng có kích thƣớc 100bp giống DT22, DT26, DT51,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DT84, băng có kích thƣớc 110bp gồm các giống DT96, DT2000, NR1, NR2.
Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Sct187
Kết quả nhân bản các phân đoạ hản ứng PCR với cặp mồi Sct_187-F/ Sct_ - 12 giống đậu tƣơng, đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. với cặp mồi Sct_187-F
/Sct187-R
M. ; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5.DT26; 6.DT51; 7.DT84;
8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Sct_187-F/ Sct_187-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT4, DT8, DT12, DT22, DT26, DT51, DT96, DT2000, DVN14, NR1 kích thƣớc từ 140bp – 170bp. Băng có kích thƣớc 140bp giống DT4, DT8, DT12, DT22, băng có kích thƣớc 150bp gồm các giống DT26, DT51, DT96, băng có kích thƣớc 170bp có giống là DT2000, DVN14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R
ệ gen của 12 giống đậ hản ứng PCR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R đƣợc ở hình 3.5.
Hình 3.5. với cặp mồi Satt431-F/
Satt431-R
M. 0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5. DT26; 6.DT51;
7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT4, DT8, DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. Các băng có kích thƣớc từ 200bp – 210bp, băng có kích thƣớc 200bp là giống DT4, DT8, băng có kích thƣớc 210bp gồm các giống DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phản ứng PCR với cặp mồi Satt460-F/Satt460-R đ sử dụng phân tích hệ gen của 12 giống đậu tƣơng, kết quả nhân bản các phân đoạn DNA đƣợc trình bày ở hình 3.6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
với cặp mồi Satt460-F /Satt460-R
0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5. DT26; 6.DT51; 7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR cặp mồi Satt460- F/Satt460-R cho thấy có kích thƣớc nhƣ nhau là 100bp xuất hiện ở các giống đậu tƣơng DT12, DT26, DT96, DT2000, DVN14, NR1. 5 chỉ thị SSR đƣợc sử dụng đều cho tính đa hình. Chỉ thị satt009 cho tỷ lệ đa hình cao nhất là 4 loại băng có kích thƣớc khác nhau, chỉ thị Satt460 cho các băng của các giống xuất hiện có kích thƣớc giống nhau. Các băng, vị trí và số phân đoạn của mỗi mồi đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. phân đoạn DNA bằng phản ứng PCR-SRR từ
5 cặp mồi SSR
TT C
SSR
Dạng SSR
Phân đoạn DNA xuất hiện ở các giống đậu tƣơng
iống đậu tƣơng không xuất hiện 1 Satt009 (ATT)14 DT8, DT12, DT96, DNV14, DT2000, NR1, NR2. 5 4 2 Sat_064 (AT)34 DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, NR1, NR2. 4 2 3 Sct_187 (CT)10 DT4, DT8, DT12, DT22, DT26, DT51, DT96, DT2000, DVN14, NR1, NR2. 2 3 4 Satt431 (ATT)21 DT4, DT8, DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. 3 2 5 Satt460 (ATT)24 DT12, DT26, DT98, DT2000, DVN14, NR1. 6 1
Qua phân tích sản phẩm điện di của phản ứng PCR-SSR với 5 cặp mồi đặc hiệu cho đậu tƣơng với 12 giống đậu tƣơng nghiên cứu nhận thấy có 4 chỉ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thị SSR: Satt009, Sat_064, Sct_187, Satt431, Satt460 cho độ đa hình cao chỉ thị Satt460 cho đa hình thấp (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. phân đoạn DNA
khi sử dụng 5 cặp mồi SSR Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản Kích thƣớc Satt009 7 180 bp: NR1. 190bp: DT96, DT2000, DV14. 200bp: DT8, DT12 210bp: NR2 Sat_064 8 100bp: DT22, DT26, DT51, DT84. 110bp: DT96, DT2000, NR1, NR2. Sct_187 10 140bp: DT4, DT8, DT12, DT22. 150bp: DT26, DT51, DT96. 170bp: DT2000, DVN14, NR1. Satt431 9 200bp: DT4, DT8. 210bp: DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. Satt460 6 100bp: DT12, DT26, DT96, DT2000, DVN14, NR1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.2. PHÂN TÍCH TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG
TƢƠNG KHÁNG BỆNH KHÁC NHAU
Sử dụng phần mềm NTSYS version 2.0 trong phân tích tính đa dạng của
12 giống đậu tƣơng dựa trên kết quả
phân tích SSR với 5 , kết quả đã xác định hệ số sai khác di của từng cặp giống đậu tƣơng nghiên cứu ảng 3.3.
3.3. (%) DT4 DT8 DT12 DT22 DT26 DT51 DT84 DT96 DT 2000 DVN 14 NR1 NR2 DT4 0,00 DT8 0,00 0,00 DT12 8,96 8,96 0,00 DT22 1,43 1,43 1,04 0,00 DT26 5,49 5,49 3,47 2,88 0,00 DT51 4,05 4,05 8,96 1,44 1,44 0,00 DT84 8,96 8,96 0,00 3,47 3,47 2,03 0,00 DT96 2,55 2,55 4,58 1,12 1,12 2,55 4,58 0,00 DT2000 2,55 2,55 4,58 1,12 1,12 2,55 4,58 0,00 0,00 DVN14 1,44 1,44 3,47 2,89 2,89 5,49 1,04 1,12 1,12 0,00 NR1 5,49 5,49 3,47 2,89 2,89 5,49 1,04 1,12 1,12 2,89 0,00 NR2 8,96 8,96 0,00 3,47 1,04 8,96 6,93 4,58 4,58 1,04 3,47 0,00
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả bảng 3.3 cho thấy hệ số sai khác di truyền của 12 giống đậu tƣơng giao động trong khoảng 0% đến 8,96%. Trong đó có cặp giống có hệ số sai khác di truyền nhỏ nhất là cặp DT4 và DT8 với hệ số sai khác là 0%. Các cặp có hệ số di truyền cao nhất là DT4 và DT12, DT8 và DT12, DT51 và DT12, DT4 và DT84, DT8 và DT84, NR2 và DT4, NR2 và DT8, NR2 và DT51, hệ số sai khác di truyền đều là 8,96%.
Từ kết quả phân tích sơ đồ hình cây đƣợc thiết lập biểu thị m quan hệ di truyền giữa 12 giống đậu tƣơn
(Hình 3.7)
12 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắ Nhánh thứ nhất Nhánh phụ thứ nhất Nhóm 2 Nhóm 1 Nhóm phụ 1 Nhóm phụ 2 N h á n h t h ứ h a i Nhánh phụ thứ hai
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phân tích sơ đồ hình cây ở hình 3.7 cho thấy 12 giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc chia thành hai nhánh chính, nhánh thứ nhấ ống nhiễm
bệ , bao gồm các
giống kháng bệnh và các giống trung gian và giống nhiễm nhẹ bệnh gỉ sắ khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 60% (1-0,40).
Nhánh thứ hai đƣợc chia làm hai nhánh phụ, nhánh phụ thứ nhất
giống đậ khoảng cách di truyền là
58%. Nhánh phụ thứ hai đƣợc chia làm hai nhóm với khoảng cách di truyền là 52%. Nhóm 1 gồm DT84, DT51, DT26 , nhóm 2 đƣợc chia làm hai nhóm phụ với khoảng cách di truyền là 36%. Nhóm phụ 1 gồm các giống NR1, DVN14, DT2000, DT96 nhóm phụ 2 gồm các giống DT4, DT8, ĐT22. 1, DT2000 ỉ sắt ở mức độ tốt 2, 8 100%,
Sơ đồ hình 3.7 cho thấy các giống đậu tƣơng khác nhau về mặt di truyền phân bố theo khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Nhƣ vậy, cũng giống nhƣ các chỉ thị phân tử khác, kỹ thuật SSR cho phép xác định nhanh mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu tƣơng tham gia thí nghiệm, điều này rất có ý nghĩa kinh tế trong việc chọn tạo giống cây trồng. 5 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng 12 giống đậu tƣơng có phản ứng khác nhau với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bệnh gỉ sắt đều biểu hiện tính đa hình. Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản từ cặp mồi SSR dao động từ 6 đến 10 . Trong 5 cặp mồi có 4 cặp mồi cho tính đa hình cao nhất với hệ số đa dạng di truyền cao. Phân tích đa dạng di truyền trên sơ đồ hình cây cho thấy khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 60%. Những thông tin này là cơ sở cho việc tuyển chọn giống đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt phục vụ sản xuất, đồng thời cũng là cơ sở cho việc lựa chọn cặp bố mẹ khác xa nhau về mặt di truyền phục vụ công tác lai tạo giống.
Để khẳng định một cách chắc chắn nhận định trên cần tiến hành một số các nghiên cứu tiếp theo nhƣ lây nhiễm nhân tạo, thực hiện các phép lai các cá thể bố mẹ thuộc các giống/dòng khác nhau và phân tích theo dõi mức độ phân ly của phân đoạn DNA đặc trƣng ở các thế hệ tiếp theo để đánh giá mức độ liên kết của chỉ thị với tính kháng bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra .
CHUNG
Bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng là một trong những bệnh hại cây đậu đỗ gây