Ảnh 3.12: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 5 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy.
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường lỏng lên sự tạo huyền phù tế bào tế bào
Mô sẹo 3 tuần tuổi được chuyển vào môi trường lỏng với thể tích thay đổi. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l, 2,4-D 1 mg/l, kinetin 1 mg/l. Hệ thống tế bào được nuôi cấy trên máy lắc vòng với tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Sau 5 ngày nuôi cấy, mô sẹo trong môi trường có thể tích 15 ml và 20 ml môi trường có sự phóng thích tế bào. Trong đó, mô sẹo trong 20 ml môi trường có sự phóng thích ít hơn nhiều so với mô sẹo trong 15 ml môi trường. Sau 21 ngày
Trang 42
nuôi cấy, huyền phù tế bào trong môi trường có thể tích 15 ml tăng trưởng mạnh hơn huyền phù tế bào trong môi trường có thể tích 20 ml (ảnh 3.13). Còn trong môi trường có thể tích 25 ml và 30 ml, mô sẹo không có sự phóng thích tế bào. Sau 21 ngày nuôi cấy, mô sẹo có sự gia tăng về kích thước và không tạo được huyền phù tế bào.
Kết quả thí nghiệm cho thấy thể tích môi trường càng tăng thì khả năng tạo huyền phù tế bào và sự tăng trưởng của huyền phù tế bào càng giảm. Sự hình thành cũng như tăng trưởng của huyền phù tế bào chịu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng, đặc biệt là auxin, và sự di chuyển của dòng môi trường trong bình nuôi cấy. Sự di chuyển của dòng môi trường giúp tăng sự trao đổi khí giữa môi trường và tế bào, tế bào sinh trưởng tốt, đồng thời cũng giúp mô sẹo phóng thích tế bào vào môi trường [1].
Trong thí nghiệm này, nồng độ chất diều hòa sinh trưởng, bình nuôi cấy và tốc độ lắc của các mẫu là như nhau. Khi thể tích môi trường lớn ( 20 ml), sự di chuyển của dòng môi trường trong bình nuôi cấy chậm, không đủ giúp cho mô sẹo phóng thích tế bào vào môi trường. Ở môi trường có thể tích 15 ml, sự di chuyển của dòng môi trường có lẽ thích hợp cho sự phóng thích tế bào, dẫn đến sự tạo huyền phù tế bào.
Như vậy, chúng tôi chọn thể tích môi trường lỏng là 15 ml (tỉ lệ giữa khối lượng mô sẹo và thể tích môi trường nuôi cấy là 0.5 g / 15 ml) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Trang 43
(a)
(b)
Ảnh 3.13: Huyền phù tế bào trong 15 ml môi trường sau 5 ngày (a) và 21 ngày (b) nuôi cấy.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào
Mô sẹo 3 tuần tuổi được chuyển vào 15 ml môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l, kinetin 1 mg/l và sucrose với nồng độ thay đổi. Hệ thống tế bào được nuôi cấy trên máy lắc vòng với tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Trang 44
Hình 3.1: Đường cong tăng trưởng của huyền phù tế bào ở các nồng độ sucrose khác nhau
Trong 7 ngày đầu, huyền phù tế bào tăng trưởng chậm, đây là pha thích nghi của tế bào với môi trường. Bắt đầu từ ngày 7 đến ngày 21 là pha huyền phù tế bào tăng trưởng mạnh. Sau ngày 21, huyền phù tế bào bắt đầu giảm tăng trưởng và dần bước vào pha suy vong. Trong đó, huyền phù tế bào tăng trưởng cực đại ở ngày 21 (hình 3.1).
Ở môi trường có sucrose nồng độ 20 g/l, huyền phù tế bào tăng trưởng yếu hơn ở các nồng độ 30 và 40 g/l, có lẽ là do sucrose nồng độ 20 g/l không đủ cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho các quá trình sống của tế bào, nên sự phân chia của tế bào diễn ra chậm. Khi tăng nồng độ sucrose, sự tăng trưởng của huyền phù tế bào tăng theo. Ở nồng độ sucrose 30 g/l, huyền phù tế bào tăng trưởng mạnh
Trang 45
nhất. Tiếp tục tăng nồng độ sucrose đến 40 g/l thì sự tăng trưởng của huyền phù tế bào giảm. Hàm lượng đường cao làm tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy, kìm hãm các hoạt động biến dưỡng của tế bào, huyền phù tế bào tăng trưởng yếu hơn huyền phù tế bào ở nồng độ đường 30 g/l. Ở nồng độ đường 50 g/l, sự tăng trưởng của tế bào bị ức chế, huyền phù tế bào gần như không có sự tăng trưởng. Tác động kích thích hay kìm hãm sự tăng trưởng huyền phù tế bào của sucrose khi được sử dụng ở các nồng độ thay đổi đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu ở các đối tượng khác nhau [3, 12, 13, 17, 20, 25]. Mori (1994) [20] khảo sát ảnh hưởng của 8 loại đường khác nhau đến sự tăng trưởng của huyền phù tế bào dâu tây (Fragaria ananassa cv. Shikinara), bao gồm sucrose, xylose, D-mannose, L- rhamnose, D-arabinose, D-galactose, D-glucose, sucrose và fructose. Kết quả của ông cũng cho thấy huyền phù tế bào tăng trưởng mạnh nhất khi môi trường bổ sung sucrose, và nồng độ sucrose thích hợp là 5 % (w/v) (50 g/l). Theo Nagarajan (1989) [17], huyền phù tế bào cà rốt (Daucus carota) tăng trưởng mạnh nhất khi sử dụng galactose 20 g/l.
Từ kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi chọn sucrose 30 g/l là nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng của huyền phù tế bào, và 21 ngày là thời điểm khảo sát sự gia tăng thể tích tế bào lắng của huyền phù tế bào cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và kinetin lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào
Mô sẹo 3 tuần tuổi được chuyển vào 15 ml môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l, 2,4-D và kinetin với nồng độ thay đổi. Hệ thống tế bào được nuôi cấy trên máy lắc vòng với tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kinetin 1 mg/l và 2,4-D nồng độ thay đổi từ 0.5 – 1.5 mg/l lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào.
Trang 46
Bảng 3.4: Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào ở môi trường bổ sung 2,4-D nồng độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Kinetin (mg/l)
2,4-D
(mg/l) SCV đầu (ml) SCV sau 3 tuần
nuôi cấy (ml) SCV (ml)
1
0.5 1.584 2.267 0.683
1 1.517 2.384 0.867
1.5 1.450 2.067 0.617
Ở cả ba nồng độ 2,4-D 0.5, 1, và 1.5 mg/l, huyền phù tế bào đều có sự tăng trưởng. Và nồng độ 2,4-D 1 mg/l kích thích huyền phù tế bào tăng trưởng mạnh nhất trong dãy nồng độ khảo sát (thể tích tế bào lắng tăng 0.867 ml sau 3 tuần nuôi cấy) (bảng 3.4).
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/l và kinetin nồng độ thay đổi từ 0.5 – 1.5 mg/l lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào.
Bảng 3.5: Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào ở môi trường bổ sung kinetin nồng độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
2,4-D (mg/l) Kinetin
(mg/l) SCV đầu (ml) SCV sau 3 tuần
nuôi cấy (ml) SCV (ml)
1
0.5 1.767 2.384 0.683
1 1.517 2.384 0.867
1.5 1.667 2.234 0.567
Theo bảng 3.5, ở cả ba nồng độ kinetin 0.5 mg/l, 1 mg/l và 1.5 mg/l, huyền phù tế bào đều có sự tăng trưởng. Trong đó, nồng độ kinetin 1 mg/l kích thích huyền phù tế bào tăng trưởng nhiều nhất (thể tích tế bào lắng tăng 0.867 ml sau 3 tuần nuôi cấy). Kết quả của thí nghiệm này cho thấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự tạo và tăng trưởng của huyền phù không có sự thay đổi so với giai đoạn tạo và tăng trưởng sẹo trước đó.
Trang 47
Như vậy, tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm 2,4-D 1mg/l và kinetin 1 mg/l được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.