Mục đích: xây dựng đường cong tăng trưởng của huyền phù tế bào bắp cải tím nhằm xác định thời điểm huyền phù tế bào đạt sinh khối lớn nhất.
Môi trường tạo huyền phù: môi trường khoáng MS kết hợp với 2,4-D 1mg/l, kinetin 1 mg/l và sucrose 30 g/l.
Phương pháp: Chuyển 0.5 g mô sẹo 3 tuần tuổi vào 15 ml môi trường lỏng, nuôi cấy trên máy lắc vòng. Tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Điều kiện nuôi cấy: Trong tối
Nhiệt độ: 24 2 C Độ ẩm: 70 2 %
Chỉ tiêu theo dõi: sự gia tăng thể tích tế bào lắng (SCV) sau 1, 2, 3 và 4 tuần.
2.3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và kinetin lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào
Mục đích: khảo sát nồng độ 2,4-D và kinetin thích hợp cho sự tăng trưởng huyền phù tế bào bắp cải tím.
Môi trường tạo huyền phù: môi trường khoáng MS kết hợp với sucrose 30 g/l, 2,4-D và kinetin nồng độ thay đổi:
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kinetin 1 mg/l kết hợp với 2,4-D nồng độ thay đổi từ 0.5 – 1.5 mg/l lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/l kết hợp với kinetin nồng độ thay đổi từ 0.5 – 1.5 mg/l lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào.
Trang 30
Phương pháp: Chuyển 0.5 g mô sẹo 3 tuần tuổi vào 15 ml môi trường lỏng có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thay đổi, nuôi cấy trên máy lắc vòng. Tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Điều kiện nuôi cấy: Trong tối
Nhiệt độ: 24 2 C Độ ẩm: 70 2 %
Chỉ tiêu theo dõi: sự gia tăng thể tích tế bào lắng (SCV) sau 3 tuần nuôi cấy.
2.3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết tảo Spirulina lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào của huyền phù tế bào
Mục đích: khảo sát nồng độ dịch chiết tảo Spirulina thích hợp cho sự tăng trưởng huyền phù tế bào bắp cải tím.
Môi trường tạo huyền phù: môi trường khoáng MS kết hợp với sucrose 30 g/l, 2,4-D 1 mg/l, kinetin 1 mg/l và dịch chiết tảo nồng độ thay đổi (0, 25, 50, 75 và 100 mg/l) .
Phương pháp: Chuyển 0.5 g mô sẹo 3 tuần tuổi vào 15 ml môi trường lỏng có nồng độ dịch chiết tảo thay đổi, nuôi cấy trên máy lắc vòng. Tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Điều kiện nuôi cấy: Trong tối
Nhiệt độ: 24 2 C Độ ẩm: 70 2 %
Chỉ tiêu theo dõi: sự gia tăng thể tích tế bào lắng (SCV) sau 3 tuần nuôi cấy. Phương pháp thu dịch chiết tảo Spirulina
Trang 31
Hình 2.3: Phương pháp thu dịch chiết tảo Spirulina
2.3.3.7. Phương pháp xác định thể tích tế bào lắng
Dụng cụ đo: bình đo thể tích tế bào lắng: bình hình cầu có cổ cao, trên cổ bình có vạch chia để đo thể tích tế bào lắng. Khoảng chia lớn nhất là 1 ml và nhỏ nhất là 0.1 ml.
Phương pháp: Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình, khi đo dốc ngược bình để toàn bộ huyền phù tế bào vào trong cổ bình. Để yên 30 phút cho tế bào lắng, đọc thể tích tế bào lắng. Hình 2.4: Bình đo thể tích tế bào lắng Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm Lọc 0.1 g bột tảo Spirulina 100 ml nước cất Dịch chiết tảo 1 mg/ml - 6 phút - Chu kì 2s, nghỉ 1s
Trang 32
Chương 3
Trang 33
3.1. Tạo cây mầm in vitro
Hạt bắp cải tím được khử trùng với dung dịch Javel 25 % trong 7 phút, và được cấy vào môi trường MS có bổ sung sucrose nồng độ 20 g/l và không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Sau 7 ngày nuôi cấy, tỉ lệ hạt nảy mầm là 97.14 %.
Hạt bắp cải tím có vỏ mỏng, thời gian khử trùng hạt càng dài sẽ tạo điều kiện cho chất khử trùng ngấm vào hạt làm chết phôi, làm giảm tỉ lệ hạt nảy mầm. Tuy nhiên, nếu thời gian khử trùng hạt quá ngắn cũng làm tăng tỉ lệ hạt bị nhiễm dẫn đến sự giảm tỉ lệ hạt nảy mầm. Kết quả tỉ lệ nảy mầm (97.14 %) cao hơn nhiều so với tỉ lệ nảy mầm do nhà sản xuất cung cấp (85 %) cho thấy thời gian khử trùng hạt 7 phút trong dung dịch Javel 25 % là thích hợp.
Ảnh 3.1: Cây mầm in vitro bắp cải tím 7 ngày tuổi
3.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo bắp cải tím
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá mầm bắp cải tím
Trang 34
Tử diệp của cây mầm bắp cải tím được cấy vào môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l, 2,4-D và kinetin với nồng độ thay đổi.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kinetin 1 mg/l kết hợp với 2,4-D nồng độ thay đổi từ 1 – 3 mg/l trên sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo.
Mẫu cấy lá mầm ban đầu có màu tím, sau khoảng 5 ngày chuyển dần sang màu xanh lá, lá mầm cong, phồng lên. Sau 7 ngày, mô sẹo dần hình thành ở những vị trí vết cắt. Sau 3 tuần nuôi cấy, sẹo hình thành có màu trắng ngà và xốp. Tỉ lệ mẫu cấy tạo sẹo được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Tỉ lệ tạo sẹo từ lá mầm bắp cải tím trên môi trường bổ sung 2,4-D nồng độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Kinetin (mg/l) 2,4-D (mg/l) Tỉ lệ tạo sẹo từ lá mầm (%)
1
1 100
2 100
3 86.54
Mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy được cấy chuyền sang môi trường mới có thành phần tương tự môi trường tạo sẹo ban đầu để khảo sát sự tăng trưởng của mô sẹo.
Bảng 3.2: Sự tăng trưởng của mô sẹo ở môi trường bổ sung 2,4-D nồng độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Kinetin (mg/l) 2,4-D (mg/l) Sự gia tăng trọng lượng tươi (g)
1
1 0.303
2 0.234
3 -0.02
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy mô sẹo trên môi trường có nồng độ 2,4-D 1 mg/l tăng trưởng nhanh nhất, mô sẹo ở môi trường có nồng độ 2,4-D 2 mg/l tăng trưởng chậm hơn. Theo sự kéo dài thời gian nuôi cấy, mô sẹo chuyển dần sang màu
Trang 35
vàng, có thể do bắt đầu có sự tổng hợp anthocyanin (ảnh 3.2, 3.3 và 3.4). Ở môi trường có 2,4-D nồng độ 3 mg/l, mô sẹo không tăng trưởng, mà còn có sự giảm khối lượng. Mô sẹo chuyển sang màu vàng nhanh hơn mô sẹo ở 2,4-D 1 mg/l và 2 mg/l, khô dần và chuyển sang màu nâu và đen. Sự giảm khối lượng có thể là do mô sẹo đi vào giai đoạn suy vong, một số tế bào bị chết làm giảm trọng lượng tươi của mô sẹo. Khả năng kích thích sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo của 2,4-D 1 mg/l cũng được chứng minh trên mô sẹo dâu tây [16, 19, 20] và mô sẹo cà rốt [21].
Trong dãy nồng độ khảo sát, 2,4-D 1 mg/l thích hợp nhất cho sự kích thích tạo sẹo và sự tăng trưởng của mô sẹo (trọng lượng tươi của mô sẹo tăng 0.303 g sau 3 tuần nuôi cấy). 2,4-D nồng độ 3 mg/l chỉ cảm ứng tạo sẹo, nhưng không thích hợp cho sự tăng trưởng của mô sẹo.
Ảnh 3.2: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 1 mg/l sau 3 tuần nuôi cấy; thang đo 1 cm.
Trang 36
Ảnh 3.3: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 2 mg/l và kinetin 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy; thang đo 1 cm.
Ảnh 3.4: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 3 mg/l và kinetin 1 mg/l sau 3 tuần nuôi cấy; thang đo 1 cm.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/l kết hợp với kinetin nồng độ thay đổi từ 0.5 – 1.5 mg/l lên sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo.
Sau 3 tuần nuôi cấy, tỉ lệ tạo sẹo của lá mầm trên môi trường bổ sung kinetin ở các nồng độ 0.5 mg/l, 1 mg/l và 1.5 mg/l đều là 100 %. Mô sẹo hình thành có màu trắng ngà và xốp. Sau đó, mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường mới có thành phần tương tự môi trường tạo sẹo ban đầu để khảo sát sự tăng trưởng của mô sẹo.
Trang 37
Bảng 3.3: Sự tăng trưởng của mô sẹo ở môi trường bổ sung kinetin nồng độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
2,4-D (mg/l) Kinetin
(mg/l) Sự gia tăng trọng lượng tươi (g)
1
0.5 0.250
1 0.331
1.5 0.172
Theo kết quả của bảng 3.3, cả ba nồng độ kinetin 0.5 mg/l, 1 mg/l và 1.5 mg/l đều có khả năng kích thích sự tạo sẹo và sự tăng trưởng của mô sẹo. Trong đó, nồng độ kinetin 1 mg/l kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo tốt nhất (trọng lượng tươi của mô sẹo tăng 0.331 g sau 3 tuần nuôi cấy), tiếp theo là kinetin nồng độ 0.5 mg/l và 1.5 mg/l (ảnh 3.5, 3.6 và 3.7). Khả năng kích thích sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo của kinetin 1 mg/l cũng được chứng minh trên mô sẹo Rosa hybrida
cv. Charleston [4] và mô sẹo cà rốt [21].
Từ các kết quả trên, chúng tôi chọn tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm 2,4-D 1mg/l và kinetin 1 mg/l để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.5: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 0.5 mg/l sau 3 tuần nuôi cấy; thang đo 1 cm.
Trang 38
Ảnh 3.6: Mô sẹo sơ cấp trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 1 mg/l sau 3 tuần nuôi cấy; thang đo 1 cm.
Ảnh 3.7: Mô sẹo sơ cấp trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 1.5 mg/l sau 3 tuần nuôi cấy; thang đo 1 cm.
3.3. Khảo sát sự tạo huyền phù tế bào
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của độ tuổi mô sẹo lên sự tạo huyền phù tế bào
Mô sẹo 1, 2, 3, 4 và 5 tuần tuổi được chuyển vào 10 ml môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l; 2,4-D 1 mg/l, kinetin 1 mg/l. Hệ thống tế bào được nuôi cấy trên máy lắc vòng với tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Trang 39
Sau 5 ngày nuôi cấy, mô sẹo 1, 2 và 3 tuần tuổi bắt đầu có sự phóng thích tế bào vào môi trường lỏng. Sau 7 ngày, mô sẹo 1 tuần tuổi phóng thích tế bào ít nhất, mô sẹo 3 tuần tuổi phóng thích tế bào vào môi trường lỏng nhiều nhất. Mô sẹo 4 và 5 tuần tuổi sau khi được chuyển sang môi trường lỏng bị vỡ ra thành những khối mô sẹo có kích thước nhỏ hơn, và gần như không có sự phóng thích tế bào như mô sẹo 3 tuần tuổi.
Sau 21 ngày nuôi cấy, huyền phù tế bào từ mô sẹo 1 và 2 tuần tuổi không có sự thay đổi đáng kể (ảnh 3.8 và 3.9). Huyền phù tế bào từ mô sẹo 4 và 5 tuần tuổi cũng không có sự thay đổi đáng kể (ảnh 3.11 và 3.12). Huyền phù tế bào từ mô sẹo 3 tuần có sự thay đổi rõ rệt, có sự gia tăng số lượng các tế bào đơn và cụm tế bào trong môi trường nuôi cấy (ảnh 3.10).
Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào bao gồm sự phân chia, sự tạo nhóm và sự tách rời tế bào. Khi các tế bào đang trong giai đoạn phân chia mạnh, tế bào có khuynh hướng kết cụm với nhau do khuynh hướng liên kết của tế bào. Sự tách rời tế bào thường xảy ra khi mô sẹo đi vào giai đoạn ổn định [1]. Có thể do mô sẹo 1 và 2 tuần tuổi đang trong giai đoạn phân chia tế bào để tạo sẹo, do đó sự tách rời tế bào khó xảy ra, mô sẹo ít phóng thích tế bào vào môi trường và do đó huyền phù tế bào ít tăng trưởng. Mô sẹo 3 tuần tuổi có thể đã bước vào giai đoạn ổn định, sự tách rời tế bào diễn ra mạnh mẽ hơn, tế bào phóng thích vào môi trường nhiều và huyền phù tế bào tăng trưởng nhanh. Mô sẹo 4 và 5 tuần tuổi có thể đã bước vào giai đoạn suy vong, mối liên kết giữa tế bào với tế bào không còn chặt chẽ. Khi vào môi trường lỏng với tác dụng của máy lắc, mô sẹo phân tán thành các mảnh có kích thước nhỏ hơn. Trong giai doạn suy vong, số tế bào chết đi nhiều hơn số tế bào được sinh ra, do đó huyền phù tế bào không tăng trưởng.
Tóm lại, mô sẹo 1 và 2 tuần tuổi có sự phóng thích tế bào vào môi trường lỏng, nhưng sự tăng sinh của huyền phù tế bào rất chậm. Mô sẹo 4 và 5 tuần tuổi không thích hợp làm nguyên liệu tạo huyền phù tế bào. Mô sẹo 3 tuần tuổi phóng thích tốt tế bào vào môi trường và huyền phù tế bào tăng trưởng nhanh. Như vậy, chúng tôi chọn mô sẹo 3 tuần tuổi để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Trang 40
Ảnh 3.8: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 1 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy.
Ảnh 3.9: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 2 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy.
Trang 41
Ảnh 3.11: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 4 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy.
Ảnh 3.12: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 5 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy.
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường lỏng lên sự tạo huyền phù tế bào tế bào
Mô sẹo 3 tuần tuổi được chuyển vào môi trường lỏng với thể tích thay đổi. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l, 2,4-D 1 mg/l, kinetin 1 mg/l. Hệ thống tế bào được nuôi cấy trên máy lắc vòng với tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Sau 5 ngày nuôi cấy, mô sẹo trong môi trường có thể tích 15 ml và 20 ml môi trường có sự phóng thích tế bào. Trong đó, mô sẹo trong 20 ml môi trường có sự phóng thích ít hơn nhiều so với mô sẹo trong 15 ml môi trường. Sau 21 ngày
Trang 42
nuôi cấy, huyền phù tế bào trong môi trường có thể tích 15 ml tăng trưởng mạnh hơn huyền phù tế bào trong môi trường có thể tích 20 ml (ảnh 3.13). Còn trong môi trường có thể tích 25 ml và 30 ml, mô sẹo không có sự phóng thích tế bào. Sau 21 ngày nuôi cấy, mô sẹo có sự gia tăng về kích thước và không tạo được huyền phù tế bào.
Kết quả thí nghiệm cho thấy thể tích môi trường càng tăng thì khả năng tạo huyền phù tế bào và sự tăng trưởng của huyền phù tế bào càng giảm. Sự hình thành cũng như tăng trưởng của huyền phù tế bào chịu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng, đặc biệt là auxin, và sự di chuyển của dòng môi trường trong bình nuôi cấy. Sự di chuyển của dòng môi trường giúp tăng sự trao đổi khí giữa môi trường và tế bào, tế bào sinh trưởng tốt, đồng thời cũng giúp mô sẹo phóng thích tế bào vào môi trường [1].
Trong thí nghiệm này, nồng độ chất diều hòa sinh trưởng, bình nuôi cấy và tốc độ lắc của các mẫu là như nhau. Khi thể tích môi trường lớn ( 20 ml), sự di chuyển của dòng môi trường trong bình nuôi cấy chậm, không đủ giúp cho mô sẹo phóng thích tế bào vào môi trường. Ở môi trường có thể tích 15 ml, sự di chuyển của dòng môi trường có lẽ thích hợp cho sự phóng thích tế bào, dẫn đến sự tạo huyền phù tế bào.
Như vậy, chúng tôi chọn thể tích môi trường lỏng là 15 ml (tỉ lệ giữa khối lượng mô sẹo và thể tích môi trường nuôi cấy là 0.5 g / 15 ml) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Trang 43
(a)
(b)
Ảnh 3.13: Huyền phù tế bào trong 15 ml môi trường sau 5 ngày (a) và 21 ngày (b) nuôi cấy.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên sự tăng trưởng của huyền phù tế bào
Mô sẹo 3 tuần tuổi được chuyển vào 15 ml môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l, kinetin 1 mg/l và sucrose với nồng độ thay đổi. Hệ thống tế bào được nuôi cấy trên máy lắc vòng với tốc độ lắc 100 vòng / phút.
Trang 44