Khác với phƣơng pháp đếm trực tiếp, phƣơng pháp này cho phép xác định số lƣợng vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Do vậy phƣơng pháp này gọi là phƣơng pháp đếm
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 39
khuẩn lạc (colony count). Phƣơng pháp này cho phép định lƣợng chọn lọc vi khuẩn.
2.4.1. Khử trùng dụng cụ và môi trường
* Khử trùng môi trường, dụng cụ bằng nồi hấp áp lực.
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nƣớc bão hòa dƣới một áp suất lớn hơn áp suất khí quyển. Phƣơng pháp này cho phép diệt cả tế bào sinh dƣỡng lẫn bào tử của vi sinh vật.
Trình tự sử dụng: Bổ sung nƣớc ở đáy nồi đến vạch quy định. Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá. Đậy kín nắp nồi hấp, mở van thông hơi giữa hai nồi, bật công tắc điện đun nồi hấp, khi nhiệt độ lên 80o
C hay 0,5 atm mở từ từ van xả để đuổi hết không khí ra khỏi nồi.
* Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng phương pháp nhiệt độ khô.
Các đĩa Petri thủy tinh, ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể đƣợc khử trùng bằng phƣơng pháp sấy ở 180oC khoảng 2h trong tủ sấy. Trong trƣờng hợp này các ống hút cần đƣợc nhét nút bông không thấm nƣớc ở đầu hút. Đĩa Petri thủy tinh, ống hút, các dụng cụ khử trùng khác đƣợc gói kín bằng giấy nhôm trƣớc khi sấy. Các ống hút có thể đƣợc đặt chung trong một ống bằng thép không gỉ trƣớc khi cho vào tủ sấy.
2.4.2 Quy trình của phương pháp đếm khuẩn lạc
Sau đây là quy trình thao tác xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 40
Mẫu đƣợc pha loãng tuần tự thành các nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000…mỗi bậc pha loãng là 1/10 đƣợc thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu (hoặc dung dịch có nồng độ pha loãng trƣớc đó) thêm vào 9ml nƣớc hoặc môi trƣờng trong một ống nghiệm. Sau khi lắc kỹ sẽ đƣợc độ pha loãng 1/10. Có thể tiến hành bằng các thể tích khác ví dụ: 0,5 ml + 4,5 ml trong ống nghiệm hoặc 0,1 ml + 0,9 ml trong ống eppendorf. Để pha loãng 100 lần có thể thực hiện bằng cách tổ hợp 0,1 ml + 9,9 ml hay 0,05 ml + 0,495 ml. Thông thƣờng cần thực hiện dãy nhiều nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp để đƣợc nồng độ pha loãng thích hợp.
*Tạo hộp trải hay hộp đổ
Sau khi tạo hộp ta ủ ở thời gian, nhiệt độ thích hợp.
*Tính toán kết quả
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di đƣợc tính theo công thức là:
Mi (CFU/ml) = Ai × Di/V
Trong đó Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa, Di là độ pha loãng và V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Mật độ trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
Công thức nêu trên đƣợc áp dụng khi cả hai đĩa của cùng một độ pha loãng cho số khuẩn lạc thích hợp. Nhƣ vậy, khi chỉ có một độ pha loãng thì cặp đĩa cho số lƣợng khuẩn lạc thích hợp (25 - 250 khuẩn lạc/đĩa) đó chính là mật độ của vi sinh vật trong mẫu. Nếu có 2 hay nhiều mẫu pha loãng mà mỗi độ pha loãng đều có cặp đĩa cho số lƣợng khuẩn lạc thích hợp thì mật độ vi sinh trong mẫu là trung bình cộng của các Mi.
2.5. Quy trình đánh giá hoạt tính khử khuẩn E.Coli và Coliforms của vật liệu Ag/Than hoạt tính Ag/Than hoạt tính
Các bƣớc tiến hành thí nghiệm để đánh giá hoạt tính khử khuẩn E.Coli, Coliforms
của vật liệu Ag/Than hoạt tính đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Cân 0,1g vật liệu vào ống nghiệm.
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 41
- Hút 1ml dung dịch này cho vào 49ml nƣớc cất và lắc đều.
Lấy 4,5ml dung dịch thu đƣợc ở trên cho vào ống nghiệm, bổ sung 0,5ml vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
E.Coli hoặc Coliforms vào, lắc đều và để cho vi khuẩn tiếp xúc trong 10 phút. - Trung hòa bằng muối và tiến hành phân tích.
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 42
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tổng hợp vật liệu
3.1.1. Kết quả điều chế dung dịch nano bạc
Dung dịch nano bạc thu đƣợc có màu vàng đậm. Chất ổn định dùng cho nano bạc là polyme polyvinylpyrolidon (PVP) do PVP có thể điều khiển tốc độ phản ứng khử ion bạc và quá trình keo tụ của nguyên tử bạc trong dung dịch.
Nghiên cứu tƣơng tác giữa PVP và hạt nano bạc cho thấy trong trƣờng hợp hạt có đƣờng kính dƣới 50nm, nguyên tử Nitơ trên PVP tƣơng tác với bạc tạo thành vỏ bảo vệ [40].
Hình 3.1: Dung dịch chứa nano bạc
Theo Huang và Carotenuto [14,17] trong thực tế phản ứng khử có thể xảy ra sau sự tƣơng tác của bạc và PVP. Trong trƣờng hợp này, phức giữa ion bạc và PVP đƣợc tạo thành, tiếp theo là phản ứng khử bạc nguyên tử trên PVP.
Sự tạo thành nguyên tử bạc đƣợc giải thích bằng phản ứng khử ion Ag+ với tác nhân khử là NaBH4 nhƣ sau [36] : 3 6 2 2 4 3 B H N a N O 2 1 H 2 1 Ag NaBH AgNO
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 43
dịch bạc phụ thuộc vào nồng độ của PVP và muối bạc (vàng nhạt đến vàng đậm). Dung dịch nano bạc có màu vàng thay đổi là do phổ hấp thụ electron của các hạt nano bạc nằm trong khoảng từ 400 đến 490 nm.
3.1.2. Kết quả chế tạo vật liệu nano bạc mang trên than hoạt tính
Các mẫu vật liệu tổng hợp đƣợc liệt kê trong bảng sau:
Bảng 3.1: Các mẫu vật liệu nano bạc mang trên than hoạt tính được tổng hợp
Mẫu vật liệu
Nồng độ bạc (% khối lƣợng bạc /chất mang)
Loại chất mang than hoạt tính sử dụng
Than gáo dừa Silic cacbon (SiC)
Ag(0,1)-T-SA 0,1 x Ag(0,3)-T-SA 0,3 x Ag(0,5)-T-SA 0,5 x Ag(0,7)-T-SA 0,7 x Ag(1,0)-T-SA 1,0 x Ag(0,1)-T-BX 0,1 x Ag(0,3)-T-BX 0,3 x Ag(0,5)-T-BX 0,5 x Ag(0,7)-T-BX 0,7 x Ag(1,0)-T-BX 1,0 x Ag(0,1)-SiC-SA 0,1 x Ag(0,3)-SiC-SA 0,3 x Ag(0,5)-SiC-SA 0,5 x Ag(0,7)-SiC-SA 0,7 x Ag(1,0)-SiC-SA 1,0 x Trong đó:
SA: Điều chế dung dịch chứa nano bạc bằng phƣơng pháp khử hóa học kết hợp siêu âm.
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 44
3.2. Kết quả đặc trƣng bằng các phƣơng pháp hóa lý
3.2.1. Kết quả đặc trưng của dung dịch chứa nano bạc điều chế bằng phương pháp khử hóa học kết hợp siêu âm
* Kết quả đặc trưng bằng phương pháp hiển vi điện tử quét phát xạ (FE-SEM)
Để quan sát đƣợc hình thái cấu trúc của các hạt nano bạc, mẫu dung dịch chứa nano bạc đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp ghi ảnh FE-SEM. Kết quả đƣợc đƣa ra trong hình 3.2.
Hình 3.2: Ảnh FE-SEM của dung dịch chứa nano bạc điều chế bằng phương pháp khử hóa học kết hợp siêu âm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh FE-SEM của mẫu dung dịch chứa nano bạc cho thấy các hạt nano bạc có dạng khối cầu, kích thƣớc tƣơng đối đồng đều tập trung trong khoảng 5-15 nm phân tán khá đều trong dung dịch.
* Kết quả đặc trưng bằng phương pháp TEM
Để phân tích rõ hơn về hình thái cấu trúc các hạt nano bạc thu đƣợc, mẫu dung dịch chứa nano bạc tiếp tục đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Kết quả ảnh TEM của mẫu đƣợc thể hiện trên hình 3.3. Trên ảnh TEM thu đƣợc ta thấy sự tồn tại các hạt nano bạc kích thƣớc các hạt tƣơng đối đồng đều và phân tán đều trong dung dịch chứa nano bạc.
Quan sát trên hình 3.3 ta thấy dung dịch nano bạc đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp khử hóa học kết hợp siêu âm chứa các hạt nano bạc có kích thƣớc chủ yếu trong khoảng 5-
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 45
12 nm, nhỏ hơn so với các hạt nano bạc đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp khử hóa bức xạ (19 -34 nm). Nhƣ vậy, có thể việc sử dụng tác nhân khử mạnh là NaBH4 cộng thêm tác động của sóng siêu âm giúp cho phƣơng pháp khử hóa học kết hợp siêu âm tạo ra các hạt nano bạc có kích thƣớc nhỏ hơn.
(a)
(b)
Hình 3.3: Ảnh TEM của dung dịch chứa nano bạc điều chế bằng
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 46
Quan sát hình 3.3 ta thấy các hạt nano bạc đƣợc phân tán trong polyme một cách riêng biệt và không bị biến đổi hình dạng, kết quả này cũng chứng tỏ PVP đã bảo vệ có hiệu quả các hạt nano bạc và giữ ổn định cho dung dịch nano bạc.
3.2.2. Kết quả đặc trưng vật liệu nano bạc mang trên than hoạt tính
3.2.2.1. Kết quả đặc trưng bằng phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)
(a)
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 47
(c)
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 48
(e)
(f)
Hình 3.4: Giản đồ XRD của mẫu Ag(0,1)-T-SA (a), Ag(0,3)-T-SA (b), Ag(0,5)-T-SA (c) Ag(0,7)-T-SA (d), Ag(1,0)-T-SA (e) và phổ chồng của các mẫu Ag(0,1)-T-SA, Ag(0,3)-T-SA ,
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 49
(a)
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 50
(c) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 51
(e)
(f)
Hình 3.5: Giản đồ XRD của mẫu Ag(0,1)-SiC-SA (a), Ag(0,3)-SiC-SA (b), Ag(0,5)-SiC-SA (c), Ag(0,7)-SiC-SA (d), Ag(1,0)-SiC-SA (e), và phổ chồng của các mẫu Ag(0,1)-SiC-SA,
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 52
(a)
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 53
(c)
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 54
(e)
(f)
Hình 3.6: Giản đồ XRD của mẫu Ag(0,1)-T-BX (a), Ag(0,3)-T-BX (b), Ag(0,5)-T-BX (c) Ag(0,7)-T-BX (d), Ag(1,0)-T-BX (e), và phổ chồng của các mẫu Ag(0,1)-T-BX,
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 55
Pha tinh thể của vật liệu nano bạc mang trên than hoạt tính đƣợc đặc trƣng bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X. Giản đồ XRD cho thấy cấu trúc tinh thể của nano bạc tổng hợp đƣợc có cấu trúc lập phƣơng tâm mặt. Quan sát trên hình 3.6 và hình 3.7 ta thấy có các píc đặc trƣng cho bạc ở 2θ = 38.20
, 2θ = 44,10, 2θ = 64,40 lần lƣợt ứng với các mặt (111), (200), (220) của tinh thể bạc. Kết quả thu đƣợc phù hợp với kết quả trong một số các nghiên cứu khác [21,30,35,46].
Hình 3.6b là giản đồ XRD của các mẫu Ag(0,1)-T-SA, Ag(0,3)-T-SA, Ag(0,5)-T-SA, Ag(0,7)-T-SA, Ag(1,0)-T-SA. Quan sát trên hình ta thấy sự xuất hiện các pic đặc trƣng cho Ag ứng với vị trí 2θ = 38.20, 2θ = 44,10, 2θ = 64,40 tăng dần và rõ nét dần theo thứ tự từ mẫu Ag(0,1)-T-SA đến Ag(1,0)-T-SA. Hiện tƣợng này có thể giải thích là do sự tăng hàm lƣợng nano bạc đƣợc tẩm lên các mẫu theo thứ tự trên. Giản đồ XRD của mẫu Ag(0,1)-T-SA gần nhƣ không thấy các píc đặc trƣng cho bạc vì hàm lƣợng nano bạc đƣa lên mẫu vật liệu này rất nhỏ (chiếm 0,1% về khối lƣợng). Ta có thể thấy rõ ràng sự xuất hiện các píc của bạc trên phổ XRD của mẫu Ag(1,0)-T-SA (có hàm lƣợng chiếm 1% về khối lƣợng mẫu). Trên hình 3.7b và hình 3.8b ta cũng thấy hiện tƣợng tƣơng tự.
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 56
3.2.2.2. Kết quả đặc trưng bằng phương pháp phân tích AAS
Để phân tích chính xác hàm lƣợng bạc trong vật liệu sau khi tẩm, các mẫu vật liệu đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp AAS. Kết quả đƣợc đƣa ra trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả phân tích AAS các mẫu vật liệu
Mẫu vật liệu Nồng độ bạc, % khối
lƣợng theo tính toán
Kết quả phân tích AAS (%) khối lƣợng bạc Ag(0,1)-T-SA 0,1 0.099 Ag(0,3)-T-SA 0,3 0.298 Ag(0,5)-T-SA 0,5 0.489 Ag(0,7)-T-SA 0,7 0.720 Ag(1,0)-T-SA 1,0 1.021 Ag(0,1)-T-BX 0,1 0.098 Ag(0,3)-T-BX 0,3 0.299 Ag(0,5)-T-BX 0,5 0.498 Ag(0,7)-T-BX 0,7 0.712 Ag(1,0)-T-BX 1,0 1.011 Ag(0,1)-SiC-SA 0,1 0.098 Ag(0,3)-SiC-SA 0,3 0.288 Ag(0,5)-SiC-SA 0,5 0.493 Ag(0,7)-SiC-SA 0,7 0.712 Ag(1,0)-SiC-SA 1,0 1.001
Kết quả phân tích cho thấy hàm lƣợng bạc thực tế trong vật liệu sau quá trình tẩm tƣơng đƣơng nhƣ hàm lƣợng theo tính toán lý thuyết. Kết quả này chứng tỏ quá trình tẩm đƣợc thực hiện tốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 57
3.2.2.3. Kết quả đặc trưng bằng phương pháp TEM
(a)
(b)
Hình 3.7: Ảnh TEM của vật liệu nano bạc mang trên than hoạt tính với dung dịch nano bạc được chế tạo bằng phương pháp khử hóa học kết hợp siêu âm (a) và phương
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 58
Hình 3.8: Ảnh TEM của vật liệu nano bạc mang trên SiC với dung dịch nano bạc được chế tạo bằng phương pháp khử hóa học kết hợp siêu âm
Quan sát trên hình 3.4 và hình 3.5 ta thấy các hạt nano bạc đã đƣợc đƣa thành công lên các chất mang là than gáo dừa và silic cacbon. Các hạt nano bạc đƣợc phân tán khá đồng đều trên chất mang và không bị co cụm.
3.3. Khảo sát và đánh giá khả năng diệt khuẩn của vật liệu nano bạc mang trên than hoạt tính hoạt tính
Để khảo sát và đánh giá khả năng diệt khuẩn của vật liệu chúng tôi sử dụng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên hai loại vi khuẩn E.coli và Coliforms với các mẫu vật liệu tổng hợp đƣợc có các hàm lƣợng bạc khác nhau.
3.3.1 Kết quả khảo sát và đánh giá khả năng diệt khuẩn E.coli của các mẫu vật liệu
* Kết quả diệt khuẩn của các mẫu vật liệu đƣợc tẩm bằng dung dịch nano bạc thu đƣợc từ phƣơng pháp khử hóa học kết hợp siêu âm với các nồng độ bạc khác nhau trên vi khuẩn E.coli đƣợc đƣa ra trong bảng 3.3.
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 59
Hình 3.9:Kết quả diệt khuẩn E.coli trực quan của các mẫu vật liệu có nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học kết hợp siêu âm
Trong đó: (a) là mẫu đối chứng pha loãng 3 bậc
(b) là mẫu Ag(0,1)-T-SA pha loãng ba bậc sau khi tiếp xúc với khuẩn E.Coli
(c) là mẫu Ag(0,3)-T-SA pha loãng ba bậc sau khi tiếp xúc với khuẩn E.Coli
(d) là mẫu Ag(0,5)-T-SA pha loãng ba bậc sau khi tiếp xúc với khuẩn E.Coli
(e) là mẫu Ag(0,7)-T-SA pha loãng ba bậc sau khi tiếp xúc với khuẩn E.Coli
(f) là mẫu Ag(1,0)-T-SA pha loãng ba bậc sau khi tiếp xúc với khuẩn E.Coli
(g) là mẫu Ag(0,1)-SiC-SA pha loãng ba bậc sau khi tiếp xúc với khuẩn E.Coli
Trần Thị Bích Hạnh Viện Hóa học - Viện KHCN Việt Nam 60
Bảng 3.3: Kết quả diệt khuẩn E.coli của các mẫu vật liệu có nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học kết hợp siêu âm
Tên mẫu Nồng độ E.coli ban đầu (cfu/ml) Nồng độ vi khuẩn E.coli còn lại (cfu/ml) Lƣợng E.coli bị tiêu diệt (%) Mẫu đối chứng 2,0.105 - 0,00 Ag(0,1)-T-SA - 2,4. 104 88,00 Ag(0,3)-T-SA - 63 99,97 Ag(0,5)-T-SA - 20 99,99 Ag(0,7)-T-SA - 15 99,99 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});