GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 52 -
Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ. Staphylococcus aureus phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu phân lập được từ da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trong thực phẩm Staphylococcus aureus
nhiễm vào chủ yếu qua con đường chế biến.[3]
4.3.4.1. Đặc tính và hình thái của Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, hình cầu
thường kết dạng chùm, gram (+), không sinh bào tử, không di động, có đường kính khoảng 1μm, phát triển tốt nhất ở 370C (giới hạn nhiệt độ của chúng từ 100C - 450C và pH 7,2 - 7,4), có phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Ngoài ra còn các đặc điểm như có phản ứng phosphatease dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, có khả năng phát triển trên môi trường chứa đến 15% muối, mẫn cảm với novobiocine. Một số dòng
Staphylococcus aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu. Hầu hết
các dòng thuộc loài này có thể tổng hợp sắc tố vàng và độc tố enterotoxin, độc tố này được sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35 - 370C và không bị phân huỷ ở 1000C trong vòng 30 phút.
Hình 4.11: Khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus trên môi trường Mannitol salt agar.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 53 -
4.3.4.2. Cơ chế gây bệnh của Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng.
Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh
sản sau đó sinh nội độc tố enterotoxin A, B, C, D, E gây ngộ độc thực phẩm. 4.3.4.3. Các triệu chứng khi nhiễm Staphylococcus aureus
Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố enterotoxin của Staphylococcus aureus,
sau 4 – 6h ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mửa, đau bụng, nhức đầu có khi ra mồ hôi, co giật cơ, huyết áp hạ, mạch yếu…
4.4. Phương pháp xác đinh vi sinh vật trong sữa.
4.4 1. Định lượng Coliforms trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
4.4.1.1. Môi trường sử dụng
- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA). - Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB).
- Môi trường Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
4.4.1.2. Nguyên tắc
Để định lượng Coliforms cần cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường
thạch chọn lọc, sau khi ủ ở 370C trong khoảng thởi gian 24h, đếm số lượng khuẩn lạc
Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc
là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trường còn chứa muối mật là tác nhân chỉ chọn lọc cho vi khuẩn gram âm. Khẳng định các vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình bằng môi trường canh chọn lọc như Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL).
4.4.1.3. Quy trình phân tích a) Quy trình thực hiện
Hút 10ml sữa tươi + 90 ml nước cất vô trùng hoặc NaCl 85%, đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng 10-1, cấy 1ml dịch pha loãng vào 2 đĩa petri trống, vô trùng
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 54 -
vào 10-15ml môi trường VRB để đông đặc lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24h.
Quan sát đĩa đối chứng mô tả khuẩn lạc ( khuẩn lạc đăc trưng trên môi trường VRB: có màu đỏ đến đỏ đậm có quần tủa muối mật đường kính lớn hơn hay bằng 0.5 mm) chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống BGBL ủ ở 370C/ 24h. b) Đọc kết quả: quan sát sự sinh hơi trên môi trường BGBL :
- Ống BGBL dương tính : môi trường đục và ống durham nổi hoặc có bọt khí trong ống .
- Ống BGBL âm tính : không có hiện tượng gì xảy ra c) Tính toán
- Tỷ lệ xác nhận R
Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL R = --- Số khuẩn lạc đã cấy - Số lượng Coliforms Trong đó: + N: Tổng số khuẩn lạc đếm được + n : Số đĩa
+ V: Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa + f : Độ pha loãng (f = 1)
+ R: Tỷ lệ xác nhận.
N
C ( CFU/ml) = --- . R n.V.f
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 55 -
4.4.2. Định lượng Escherichia coli (E.coli) trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương
pháp lên men nhiều ống MPN ( Most Probable Number)
Đây là phương pháp dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố của vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mẫu được cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của từng loại vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu đã được pha loãng. Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp. Ghi nhận lại số ống cho kết quả dương tính và âm tính của từng độ pha loãng. Tra kết quả nhận được bằng bảng Mac Crady để tính mật độ vi
sinh vật. Phương pháp MPN được dùng để định lượng E.coli khi chúng phát triển
được trong môi trường lỏng và tạo ra các tín hiệu dễ dàng nhận dạng như: sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, làm thay đổi pH của môi trường...
4.4.2.1. Các hệ thống thường dùng trong phương pháp lên men nhiều ống MPN - Hệ thống 1: Mỗi dãy 2 ống
Dãy 1 3 ống 10ml mẫu nước Dãy 2 3 ống 1ml mẫu nước Dãy 3 3 ống 0,1ml mẫu nước
- Hệ thống 2: Mỗi dãy 5 ống
Dãy 1 5 ống 10ml mẫu nước Dãy 2 5 ống 1ml mẫu nước Dãy 3 5 ống 0,1ml mẫu nước 4.4.2.2. Nguyên tắc
Số lượng E.coli có thể xác định được bằng phương pháp MPN. Phương pháp
này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân liên tiếp (hai nồng độ kế tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp có chứa ống durnham, ủ và đọc số ống có kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng
MPN để xác định số lượng E.Coli /100ml.
4.4.2.3. Quy trình phân tích a) Cấy mẫu
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 56 -
Xếp 6 ống nghiệm môi trường Lastose broth có chứa ống durnham lên giá ống nghiệm làm 2 dãy (hệ thống 1, mỗi dãy 3 ống nghiệm):
- Lấy 10ml mẫu cho vào 3 ống dãy 1 - Lấy 1ml mẫu cho vào 3 ống dãy 2
Lắc nhẹ để mẫu trộn đều vào môi trường, tránh tạo bọt khí, ủ ở 440C trong 24h.
b) Tăng sinh
Chọn các ống nghiệm sinh khí (+) cấy chuyển sang môi trường canh EC có chứa ống durnham (cấy chuyển theo 3 dãy tương ứng), ủ ở 440C trong 24h.
c) Phân lập
Chọn các ống nghiệm có sinh khí (+) cấy chuyển sang môi trường EMB, ủ ở 370C trong 24h (cấy chuyển theo 3 dãy tương ứng).
d) Khẳng định
Chọn các khuẩn lạc tròn, dẹt, có hình đĩa và có ánh kim tím cấy chuyển sang môi trường thử nghiệm pháp IMViC, ủ ở 370C trong 24h.
e. Đọc kết quả
Đọc kết quả những ống nghiệm cho nghiệm pháp IMViC (+)(+)(-)(-). Tra
bảng MPN để xác định số lượng E. Coli được biểu diễn với đơn vị MPN/100ml.
4.5. Đề xuất một số biện pháp hạn chế
4.5.1 Phương pháp hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật vào sữa khi sữa vừa mới vắt mới vắt
Sữa sau khi được vắt hầu như không được sữ dụng ngay tức thời hay đem chế biến ngay mà phải lưu lại một thời gian sau khi vắt và vận chuyễn sữa khỏi nông trại. Do đó trong giai đoạn này nhất thiết sữa phải được bảo quản trong những điều kiện nhất định nhằm ỗn định chất lượng ban đầu của sữa vì nếu không sữa rất dễ bị nhiễm vi sinh vật do sữa là môi trường chúa rất nhiều chất dinh dưỡng thích hơp cho vi sinh vât phát triển.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 57 -
- Trước khi vắt bò phải được tắm sạch, vú của con bò lấy sữa phải được rữa sạch và rữa lại bằng nước ấm, sau đó được lau khô bằng khăn sạch.
- Các công nhân vắt sữa phải được đội mũ vải, đeo khẩu trang, mặt quần áo choàng sạch sẽ. Công nhân bị bệnh truyển nhiễm phải nghỉ, những người bị bệnh mà đã được chữa khỏi nên được xắp xếp làm những công việc không tiếp xúc với sữa nữa.
- Nơi vắt sữa phải được quét don sạch sẽ phải thoáng mát. Các đồ dùng vắt sữa, đồ dùng chứa sữa phải được rữa kỹ bằng nước lã rồi dùng nước nóng hòa chất sát trùng clorua vôi giội lại hoặc đun sôi, hấp hoặc sấy thanh trùng nếu có điều kiện.
- Sữa vắt xong nên lọc vài lần bằng vải màn rồi giữ lạnh ngay bằng cách ngâm vào dòng nước chảy, hoặc ủ nước đá tốt nhất là giữ ở kho lạnh nhiệt đô dưới 100C để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và các quá trình lên men làm mất phẩm chất của sữa tươi.
- Phải tính toán để hạn chế số lần rót sữa từ đồ chứa này sang đồ chứa khác, vì mỗi lần rót tạo điều kiện cho vi sinh vật xâm nhập vào sữa để phá hoại.
- Phương pháp bảo quản lạnh tốt nhất là giữ lạnh ở dưới 60C đặc biệt ở 3 – 50C. tuy nhiên ở nhiệt độ thấp một số vi khuẩn ưa lạnh như Pseudomonas, Alialigenes, Flavobacterium, Proteus… vẫn có thể phát triển được trong sữa, một số
vi khuẩn này có khả năng phân hủy protein và lipit. Vì vậy sữa bảo quản sau khi vận chuyển đến nhà máy phải thanh trùng ngay theo phương pháp pasto.
- Một trong những biện pháp có hiệu lực để giữ chất lượng của sữa là ly tâm sữa. người ta thương ly tâm sữa để tách bỏ các hạt cặn rắn, rác bẩn. sữa đã ly tâm dể thanh trùng hơn, vi sinh vật dễ bị tiêu diệt hơn. Một số nước tiên tiến đã dùng máy ly tâm siêu tốc 14000-16000 vòng/ phút để tách bỏ vi khuẩn ra khỏi sữa. Xữ lý theo phương pháp này có thể loại bỏ đến 99.9% số lượng vi khuẩn có trong sữa mà vẫn giữ được chất lượng và mùi vị của sữa hơn các biện pháp thanh trùng pasto.
4.5.2 Các phương pháp bảo quản sữa
Sữa sau khi vắt, lượng vi sinh vật thay đổi khá nhiều. Bản thân sữa còn chứa nhiều hệ enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh hóa làm giảm giá trị chất lượng sữa.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 58 -
Để hạn chế sữa bị giảm chất lượng, người ta phải tiến hành bảo quản sữa ở điều kiện thích hợp. Có nhiều phương pháp khác nhau để bảo quản sữa:
- Phương pháp vật lý: làm lạnh, đun nóng.
- Phương pháp hóa học: sử dụng một số hóa chất để tiêu diệt hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.
- Hiện nay các phương pháp thường sử dụng là: 4.5.2.1 Phương pháp bảo quản lạnh
Người ta dùng nhiệt độ thấp để ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi yêu cầu kỹ thuật tương đối phức tạp. Các vi sinh vật lên men chua sữa thường bị ngừng phát triển ở 10oC và bị ức chế tại 2-3oC. Trái lại người ta nhận thấy rằng một số vi khuẩn có khả năng tồn tại ở 0oC phân hủy protein tạo nên một số chất độc đối với người sử dụng, nhất là đối với trẻ sơ sinh. Do vậy, để ngừng sự phát triển của vi sinh vật trong sữa cần làm lạnh sữa ở nhiệt độ dưới điểm băng. Nhưng một số vi khuẩn vẫn tồn tại, chờ sữa tan là họat động trở lại và gây hư hỏng. Như vậy, bảo quản lạnh chỉ có tác dụng đối với sữa vô khuẩn. Nếu sữa không cần bảo quản lâu, người ta không cần hạ nhiệt độ sữa dưới điểm băng, chỉ cần nhiệt độ thấp hơn 6oC.
4.5.2.2 Phương pháp bảo quản nóng
Nếu nhiệt độ lạnh chỉ ức chế sự phát triển của vi sinh vật thì nhiệt độ cao có thể tiêu diệt chúng ở các mức độ khác nhau. Khi đun sữa trên 60oC thì phần lớn vi sinh vật trong sữa bị tiêu diệt nhưng vần còn một số có khả năng tồn tại. Để tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật có trong sữa nhằm mục đích bảo quản lâu dài thì ta phải nâng nhiệt độ sữa lên trên 100oC. Nếu chỉ cần giữ sữa trong thời gian ngắn, ta có thể sử dụng các phương pháp thanh trùng Pasteur. Một số phương pháp thanh trùng Pasteur thường sử dụng:
- Phương pháp Pasteur ở nhiệt độ thấp: nâng nhiệt độ của sữa lên tới 63-65oC, duy trì trong 30 phút rồi làm nguội ngay.
- Phương pháp Pasteur ở nhiệt độ trung bình: đun sữa đến 72-75oC, duy trì trong 15-20 giây, sau đó làm nguội nhanh.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 59 -
- Phương pháp Pasteur ở nhiệt độ cao: nâng nhiệt độ của sữa lên 85-90oC rồi làm nguội ngay tức khắc.
Hiện nay, trong công nghiệp sản xuất sữa, nhằm nâng cao hiệu lực khử trùng, người ta sử dụng chế độ tiệt trùng UHT (Ultra High Temperature) ở nhiệt độ 135- 150oC trong vòng vài giây.
4.5.2.3 Phương pháp cô đặc và sấy khô
Phương pháp này tạo điều kiện kém thuận lợi cho vi sinh vật phát triển do có độ ẩm thấp, áp suất thẩm thấu lớn. Ngoài ra còn có một số phương pháp khác để tiêu diệt vi sinh vật nhưng ít được sử dụng hơn như:
- Dùng tia tử ngoại chiếu vào lớp sữa mỏnglàm cho hàm lượng vi sinh vật giảm đi nhưng sữa thường mất vị thơm ngon và các loại vitamin A, C cũng bị phá hủy.
- Dùng bức xạ ion hóa ta có thể dùng phương pháp này để bảo quản sữa, nhưng chi phí rất cao.
- Dùng sóng siêu âm. Siêu âm có tần số cao có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật trong sữa. Hàm lượng E.coli và Samonella giảm di 100%, còn Streptococcus và Brucella chỉ giảm đi một phần.
4.5.2.4 Phương pháp mới bảo quản sữa tươi
Tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã trình bày trước các quan chức ngành chăn nuôi, quản lý chất lượng và chủ trang trại nuôi bò sữa của Bhutan một phương pháp bảo quản sữa tươi mới đơn giản và thuận tiện. Đó là phương pháp Lactoperoxidase (oxy già hóa sữa) hay còn gọi là hệ thống LP. Bằng cách bổ sung thêm thiocynate và oxy già để kích hoạt hiệu ứng kháng khuẩn, công nghệ này cho phép kéo dài thời gian bảo quản sữa tươi từ vài giờ đến một ngày tùy theo nhiệt độ môi trường. Trên thế giới hiện nay chỉ có Trung Quốc và Cuba là thường xuyên sữ dụng công nghệ này. Lactoperoxidase sẽ liên kết với ion peroxyde. Phức này oxy hóa các cơ chất đặc trưng trên màng tế bào, dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất và kết quả là vi khuẩn có thể bị chết. Thông thường phức chất này có thể tiêu diệt các vi khuẩn gram âm và ức chế sự phát triển các vi khuẩn gram dương.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 60 -
Công nghệ này đặc biệt hữu hiệu với các nước nghèo, không có điều kiện bảo quản lạnh, các hộ chăn nuôi có quy mô nhỏ, phân tán thì phương pháp này chứng tỏ một sự ưu việt vươt trội.
Công nghệ LP đồng thời thỏa mãn bốn yêu cầu: đơn giản, giá thành rẽ, không cần thiết bị làm lạnh và an toàn cho người sữ dụng chắc chắn sẽ góp phần làm tăng