Sữa có thể bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh cho người và động vật. Nguồn nhiễm là sữa của những con bò bị bệnh hoặc từ không khí, nước, dụng cụ bị bẩn, ruồi nhặng hoặc do công nhân vắt sữa...Các vi sinh vật gây bệnh trong sữa gồm có tổng vi sinh
hiếu khí (TPC), Coliforms, E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus...Trong đó chủ
yếu là nhóm vi khuẩn đường ruột.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 47 -
Coliforms và Coliforms phân được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ
sinh thực phẩm, số lượng hiện diện của chúng trong mẫu phân tích dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Các nhà nghiên cứu cho rằng
số lượng Coliforms cao đồng nghĩa với khả năng hiện diện của các vi sinh vật khác
cũng rất lớn. Tuy nhiên mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh vẫn còn đang tranh cãi về cơ sở khoa học. Chúng được tìm thấy trong đường ruột hệ tiêu hóa động vật, trong phân, trong đất, nước hoặc thực vật nhiễm
phân có chứa Coliforms.
4.3.1.1. Đặc tính và hình thái của Coliforms
Coliforms là những vi sinh vật hình gậy, thuộc nhóm Gram (-), không tạo bào
tử, kị khí tùy tiện, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu nằm trong khoảng 30 - 440C, pH thích hợp 4,4 - 9,0. Sau 12 - 16h trên môi trường thạch chúng có khả năng phát triển mạnh
và tạo ra khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Trong sữa, Coliforms sẽ chuyển hóa
đường lactose tạo acid lactic, các acid hữu cơ khác, khí CO2, H2...Chúng cũng phân giải protein tạo ra các sản phẩm khí làm cho sữa có mùi khó chịu. Ở nhiệt độ 750C
trong khoảng thời gian 20 giây Coliforms sẽ bị tiêu diệt.
Hình 4.8: Khuẩn lạc đặc trưng của Coliform trên môi trường VRB. 4.3.1.2. Cơ chế gây bệnh của Coliforms
Đây là một loại vi khuẩn nguy hiểm đối với sức khỏe con người, nhất là đối
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 48 -
qua đường nước cầu cống. Khi sử dụng thực phẩm có chứa Coliforms, một khi vào
cơ thể người ta thì có thể xâm nhập nhanh vào máu, lan qua những cơ quan khác, rất
nguy hại cho sức khỏe.
4.3.1.3. Các triệu chứng khi nhiễm Coliforms
Khi bị nhiễm Coliforms có thể gây mủ vết thương, gây viêm phổi, nhiễm
khuẩn hệ hô hấp, suy yếu hệ miễn dịch, có thể gây chứng mệt mỏi, đau khớp xương, bắp thịt nhức nhối, lên cơn sốt, làm đau đầu. Một khi vào đến phổi thì gây những cơn ho, vào bao tử thì có thể gây chứng xuất huyết…
4.3.2. Escherichia coli (E.coli)
E. Coli là trực khuẩn đường ruột được phân lập từ phân người lần đầu tiên vào năm 1885, do Escherich và được đặt tên là Bacterium coli commune, ngày nay nó được gọi là Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli). E. coli là một trong
những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức
ăn. Sự có mặt của E.coli trong nước là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. 4.3.2.1. Đặc tính và hình thái của E.coli
E.Coli hình gậy nhỏ, ngắn (có khi gần như hình cầu), di động, Gram (-),
không tạo bào tử, kị khí tùy nghi, sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 440C, lên men glucose, sinh axit lactic nhiều hơn sinh indol, không sinh axetylmetylcacbinol, sinh CO2 và H2 (theo tỷ lệ 2: 1) và không có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon
duy nhất. Trong sữa, E.coli lên men lactose sinh hơi rất mạnh ở 440C. Trên môi trường EMB khuẩn lạc đặc trưng màu tím, ánh kim, tròn, bờ, đều, đường kính khoảng 0,5mm.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 49 -
Hình 4.9: Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường EMB
4.3.2.2. Cơ chế gây bệnh của E. coli E.coli có 2 loại độc tố:
- Ngoại độc tố: phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây
hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh.
- Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần
kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác.
E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và F41.
Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotyp. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường miệng. Ở dạ dày, nếu pH
không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn. Khi đến ruột, E.coli sẽ
chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc ruột và tác động lên nhung mao ruột.
Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E.coli. Bằng tính xuyên mạch, E.coli xâm nhập vào máu, đi đến các cơ quan nội tạng khác, tiết
độc tố gây độc cho cơ thể.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 50 -
- Vi khuẩn này có thể gây rối loạn máu, nhiễm trùng huyết, bại não và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong .
- Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli, đau thắt bao tử và
nôn ói. Triệu chứng thường bắt đầu 3 hay 4 ngày sau khi bị phơi nhiễm vi khuẩn
E.coli. Phần lớn bệnh nhân hồi phục sau vài ngày hay một tuần sau khi mắc bệnh. - Khi bị nhiễm E.coli nghiêm trọng một số triệu chứng sau đây thường được
ghi nhận: da trở nên xanh xao, cảm lạnh, cảm thấy yếu cơ, có những vết thâm tím
trên người và đi tiểu rất ít nước tiểu. 4.3.3. Salmonella spp.
4.3.3.1. Đặc tính và hình thái của Salmonella spp.
Salmonella spp. là trực khuẩn, Gram (-), kị khí tuỳ nghi, không có nha bào, có khả năng di động (trừ S. pullorum và S. gallinarum pullorumg), sinh acid từ glucose
và mannitol nhưng không lên men sacharose và lactose, không sinh indol và không phân giải ure, hầu hết các chủng đều sinh H2S (trừ S. typhi), nhiệt độ phát triển từ 15
- 450C, thích hợp ở 370C, pH thích hợp ở 7,6 nhưng nó có thể phát triển được ở pH từ 6 - 9. Với pH lớn hơn 9 hoặc nhỏ hơn 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt, khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: ở 500C trong 1 giờ, ở 700C trong 15 phút và 1000C trong 5 phút.
Ở nồng độ muối 6 - 8% vi khuẩn phát triển chậm và ở nồng độ muối 8 - 19%
thì sự phát triển của vi khuẩn bi ngừng lại. Salmonella spp. hiện diện trong tất cả các
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 51 -
Hình 4.10: Khuẩn lạc đặc trưng của samonella spp. trên môi trường XLD 4.3.3.2. Cơ chế gây bệnh của salmonella spp.
- Khả năng gây ngộ độc thực phẩm của Salmonella spp. cần có 2 điều kiện:
Thực phẩm phải bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn vì khả năng gây ngộ độc
của Salmonella spp.
Vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn. Vấn đề này phụ thuộc nhiều vào phản ứng cơ thể của từng người. Điều này giải thích hiện tượng nhiều người cùng ăn một loại thức ăn như nhau nhưng có người bị ngộ độc có người không bị, có người nhẹ, có người bị nặng…Thông thường những người già, người yếu và trẻ em bao giờ cũng bị nặng hơn.[10]
- Cơ chế gây bệnh:
Salmonella spp. theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng. Sau khi
xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh sản ở đó, một số khác đi vào hệ bạch huyết và tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết. Nhưng vì
Salmonella spp. là vi khuẩn ưa môi trường ruột nên nhanh chóng trở về ruột. Sau đó, Salmonella spp. chui qua màng nhày và vào thành ruột. Nội độc tố sẽ được thoát ra
khi vi khuẩn bị phân huỷ trong máu cũng như ở ruột, gây nhiễm độc cấp bằng một hội chứng rối loạn tiêu hoá khá nặng nề, nhưng chỉ sau 1 – 2 ngày bệnh nhân nhanh chóng trở lại bình thường không để lại di chứng, vì các tế bào niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Nhưng ở người già yếu và trẻ nhỏ có thể bị rối loạn tiêu hoá nặng hơn, đôi khi bị tử vong.
4.3.3.3. Các triệu chứng khi nhiễm Salmonella spp. Có ba dạng bệnh thực sự do Salmonella spp. gây ra: - S. typhirium và S. enterritidis gây rối loạn tiêu hoá
- S. typhi gây sốt thương hàn
Các triệu chứng do Salmonella spp. gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36h sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella spp., các
triệu chứng thường kéo dài từ 2 – 7 ngày.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 52 -
Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ. Staphylococcus aureus phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu phân lập được từ da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trong thực phẩm Staphylococcus aureus
nhiễm vào chủ yếu qua con đường chế biến.[3]
4.3.4.1. Đặc tính và hình thái của Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, hình cầu
thường kết dạng chùm, gram (+), không sinh bào tử, không di động, có đường kính khoảng 1μm, phát triển tốt nhất ở 370C (giới hạn nhiệt độ của chúng từ 100C - 450C và pH 7,2 - 7,4), có phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Ngoài ra còn các đặc điểm như có phản ứng phosphatease dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, có khả năng phát triển trên môi trường chứa đến 15% muối, mẫn cảm với novobiocine. Một số dòng
Staphylococcus aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu. Hầu hết
các dòng thuộc loài này có thể tổng hợp sắc tố vàng và độc tố enterotoxin, độc tố này được sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35 - 370C và không bị phân huỷ ở 1000C trong vòng 30 phút.
Hình 4.11: Khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus trên môi trường Mannitol salt agar.
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 53 -
4.3.4.2. Cơ chế gây bệnh của Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng.
Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh
sản sau đó sinh nội độc tố enterotoxin A, B, C, D, E gây ngộ độc thực phẩm. 4.3.4.3. Các triệu chứng khi nhiễm Staphylococcus aureus
Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố enterotoxin của Staphylococcus aureus,
sau 4 – 6h ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mửa, đau bụng, nhức đầu có khi ra mồ hôi, co giật cơ, huyết áp hạ, mạch yếu…
4.4. Phương pháp xác đinh vi sinh vật trong sữa.
4.4 1. Định lượng Coliforms trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
4.4.1.1. Môi trường sử dụng
- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA). - Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB).
- Môi trường Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
4.4.1.2. Nguyên tắc
Để định lượng Coliforms cần cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường
thạch chọn lọc, sau khi ủ ở 370C trong khoảng thởi gian 24h, đếm số lượng khuẩn lạc
Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc
là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trường còn chứa muối mật là tác nhân chỉ chọn lọc cho vi khuẩn gram âm. Khẳng định các vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình bằng môi trường canh chọn lọc như Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL).
4.4.1.3. Quy trình phân tích a) Quy trình thực hiện
Hút 10ml sữa tươi + 90 ml nước cất vô trùng hoặc NaCl 85%, đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng 10-1, cấy 1ml dịch pha loãng vào 2 đĩa petri trống, vô trùng
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 54 -
vào 10-15ml môi trường VRB để đông đặc lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24h.
Quan sát đĩa đối chứng mô tả khuẩn lạc ( khuẩn lạc đăc trưng trên môi trường VRB: có màu đỏ đến đỏ đậm có quần tủa muối mật đường kính lớn hơn hay bằng 0.5 mm) chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống BGBL ủ ở 370C/ 24h. b) Đọc kết quả: quan sát sự sinh hơi trên môi trường BGBL :
- Ống BGBL dương tính : môi trường đục và ống durham nổi hoặc có bọt khí trong ống .
- Ống BGBL âm tính : không có hiện tượng gì xảy ra c) Tính toán
- Tỷ lệ xác nhận R
Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL R = --- Số khuẩn lạc đã cấy - Số lượng Coliforms Trong đó: + N: Tổng số khuẩn lạc đếm được + n : Số đĩa
+ V: Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa + f : Độ pha loãng (f = 1)
+ R: Tỷ lệ xác nhận.
N
C ( CFU/ml) = --- . R n.V.f
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 55 -
4.4.2. Định lượng Escherichia coli (E.coli) trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương
pháp lên men nhiều ống MPN ( Most Probable Number)
Đây là phương pháp dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố của vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mẫu được cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của từng loại vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu đã được pha loãng. Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp. Ghi nhận lại số ống cho kết quả dương tính và âm tính của từng độ pha loãng. Tra kết quả nhận được bằng bảng Mac Crady để tính mật độ vi
sinh vật. Phương pháp MPN được dùng để định lượng E.coli khi chúng phát triển
được trong môi trường lỏng và tạo ra các tín hiệu dễ dàng nhận dạng như: sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, làm thay đổi pH của môi trường...
4.4.2.1. Các hệ thống thường dùng trong phương pháp lên men nhiều ống MPN - Hệ thống 1: Mỗi dãy 2 ống
Dãy 1 3 ống 10ml mẫu nước Dãy 2 3 ống 1ml mẫu nước Dãy 3 3 ống 0,1ml mẫu nước
- Hệ thống 2: Mỗi dãy 5 ống
Dãy 1 5 ống 10ml mẫu nước Dãy 2 5 ống 1ml mẫu nước Dãy 3 5 ống 0,1ml mẫu nước 4.4.2.2. Nguyên tắc
Số lượng E.coli có thể xác định được bằng phương pháp MPN. Phương pháp
này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân liên tiếp (hai nồng độ kế tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp có chứa ống durnham, ủ và đọc số ống có kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng
MPN để xác định số lượng E.Coli /100ml.
4.4.2.3. Quy trình phân tích a) Cấy mẫu
GVHD:Huỳnh Văn Thành
SVTH: Phạm Thị Ngọc Hương - 56 -
Xếp 6 ống nghiệm môi trường Lastose broth có chứa ống durnham lên giá ống nghiệm làm 2 dãy (hệ thống 1, mỗi dãy 3 ống nghiệm):
- Lấy 10ml mẫu cho vào 3 ống dãy 1 - Lấy 1ml mẫu cho vào 3 ống dãy 2
Lắc nhẹ để mẫu trộn đều vào môi trường, tránh tạo bọt khí, ủ ở 440C trong 24h.
b) Tăng sinh
Chọn các ống nghiệm sinh khí (+) cấy chuyển sang môi trường canh EC có chứa ống durnham (cấy chuyển theo 3 dãy tương ứng), ủ ở 440C trong 24h.