Kết quả thử nghiệm cho thấy hầu hết các quần thể muỗi An. dirus trong tự nhiên còn nhạy cảm với các hóa chất phòng chống vector hiện đang đƣợc sử dụng do vậy việc nghiên cứu tính kháng hóa chất của loài muỗi này gặp nhiều khó khăn. Việc chủ động tạo ra một dòng muỗi có tính kháng tƣơng đối ổn định với permethrin là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu tính kháng của loài muỗi này.
Sau khi tạo áp lực chọn lọc 23 thế hệ, chúng tôi thu đƣợc một chủng
An. dirus kháng với permethrin tƣơng đối ổn định. Nồng độ hoá chất diệt mà dòng muỗi này có thể chịu đƣợc cao gấp 23,13 lần so với nồng độ gây áp lực
98
ban đầu. Kết quả này tƣơng tự nhƣ các nghiên cứu tạo dòng kháng trên muỗi
Culex quinquefasciatus và Aedes aegypty ở Thái Lan: tùy theo từng loài muỗi và số thế hệ cần gây áp lực chọn lọc để tạo ra các dòng muỗi có tính kháng khác nhau so với thế hệ ban đầu. Theo nghiên cứu của Hamdan và cs (2005) [64] sau 40 thế hệ lựa chọn thì tỷ lệ kháng của Culex quinquefasciatus với malathion và permethrin tăng tƣơng ứng 52,7 và 15,13 lần. Đối với Aedes aegypty thì sau 32 thế hệ lựa chọn tỷ lệ tăng này lại là 4,97 và 64,2 lần.
Tiến hành thử nghiệm sinh học đánh giá trực tiếp độ nhạy cảm của An. dirus tại hai quần thể Eachrang, Sơn Hòa, Phú Yên và quần thể Đảo lớn, Côn Đảo Bà Rịa Vũng Tàu nhận thấy ở hai quần thể này muỗi An. dirus vẫn còn nhạy với hầu hết các hóa chất đƣợc thử nghiệm. Tuy nhiên quần thể Eachrang, Sơn Hòa, Phú Yên đã có biểu hiện tăng sức chịu đựng có khả năng kháng với hai loại hoá chất đang sử dụng trong chƣơng trình phòng chống sốt rét hiện nay là alpha-cypermethrin 30mg/m2 và Lambda cyhalothrin 0,05%. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Wim Van Bostel, Hồ Đình Trung và cs (2008) [111] khi nghiên cứu tính kháng của các vector sốt rét ở tiểu vùng sông Mê Kông, cụ thể là An. dirus
vẫn còn nhạy cảm với permethrin. Tuy nhiên muỗi ở miền Trung Việt Nam có thể có khả năng kháng với hoá chất thuộc nhóm II. DDT đƣợc sử dụng trong chƣơng trình tiêu diệt sốt rét trong những năm 1960, 1970 nhƣng đã đƣợc ngừng sử dụng hoàn toàn khoảng 30 năm nay. Việc An. dirus hiện nay vẫn nhạy cảm với DDT và permethrin (Hồ Đình Trung và cs, 2008, 2010 và nghiên cứu của chúng tôi) có thể cho rằng phải chăng tính kháng DDT và permethrin ở loài muỗi này là theo cơ chế kháng sinh hóa do sự tăng cƣờng hoạt động của các gen quy định các enzyme giải độc hoặc cũng có thể do đột biến trên gen quy định (ít nhất là đột biến kháng ngã gục) nhƣng ở trạng thái lặn với tần số thấp nên chƣa biểu hiện ra.
99
Kháng hóa chất của côn trùng do cơ chế thay đổi vị trí đích liên quan đến đột biến gen có thể xảy ra ở một hay nhiều điểm trên gen đích và đƣợc di truyền cho thế hệ sau. Các đột biến liên quan đến kháng hóa chất thƣờng là đột biến điểm, thay thế một nucleotide này thành một nucleotide khác làm thay đổi bộ ba mã hóa axit amin dẫn đến cấu trúc enzyme bị thay đổi. Phƣơng pháp sinh học phân tử có thể phát hiện đƣợc các cá thể kháng trong quần thể ngay cả ở tần số rất thấp. Ở giai đoạn sớm, hầu hết các cá thể dị hợp tử không phát hiện đƣợc bằng các thử nghiệm sinh học do chúng vẫn nhạy với hóa chất mang gen lặn tuy nhiên các phƣơng pháp sinh học phân tử lại có thể phát hiện sớm tính kháng.
Những nghiên cứu về tính kháng của côn trùng đối với DDT và pyrethroid là có liên quan đến gen quy định kênh vận chuyển Na. Một đột biến điểm ở trên gen đã đƣợc chứng minh có liên quan đến sự biểu hiện kháng ngã gục (knockdown resistance-Kdr). Ở hầu hết các loài côn trùng kể cả muỗi Anopheles, kháng ngã gục tiêu biểu nhất là do dột biến điểm làm thay đổi leucin thành pheninalanin ở vị trí 1014 trên đoạn kỵ nƣớc S6, cổng số II của gen quy định kênh vận chuyển Na (Martinez-Torres và cs, 1998)[73]. Ngoài ra còn có hai đột biết thay thế khác ở vị trí này cũng liên quan đến tính kháng của côn trùng với DDT và nhóm pyrethroid đó là leucin thành histidin lại có liên quan đến tính kháng với nhóm pyrethroid ở loài Heliothis virescens
hoặc leucin thành serin có liên quan đến mức độ kháng thấp ở một chủng
Culex pipiens tại Trung Quốc. Nghiên cứu của chúng tôi thiết lập một thí nghiệm để kiểm tra xem liệu có đột biến vị trí 1014L thành 1 trong 4 axit amin đã nêu trên không. Chúng tôi đã tiến hành khuếch đại gen mã hóa đoạn kỵ nƣớc S6, cổng số II gen quy định kênh vận chuyển Na (DIIS6) sau đó giải trình tự xác định bộ ba mã hóa cho axit amin leucin tại vị trí 1014. Kết quả chỉ ra rằng hầu hết các mẫu vật nghiên cứu bị cắt bởi hai enzyme Fsp1 và
100
XbA (chỉ có 15 mẫu không bị cắt), bộ ba mã hóa cho axit amin leucin tại vị trí này vẫn là CTA, không có đột biến điểm xảy ra ở những mẫu vật này. Mƣời lăm mẫu vật không bị cắt bởi enzyme giới hạn và có đột biến điểm tại vị ví 1014, tuy nhiên những đột biến này lại không tạo thành 1 trong 4 axit amin pheninalanin, serin, histidin hay cystein (là những đột biến có khả năng kháng Kdr), các đột biến đƣợc tạo ra là CTT - leucin, CAA- glutamine, GTA - valine. Đối với loài muỗi An. dirus này khả năng tìm ra một đột biến kháng ngã gục (Kdr) có liên là quan với axit amin ở bộ ba mã hóa số 1014 là rất thấp, nguyên nhân có thể do chính từ bộ ba mã hóa cho leucin ở vị trí này là CTA. Ít nhất phải có 2 sự thay thế nucleotide ở bộ ba mã hóa này mới có thể tạo ra đƣợc các bộ ba để mã hóa 1 trong 4 axit amin pheninalanin (TTT, TTC), serin (TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC), histidin (CAT, CAC) hay cystein (TGT, TGC). Nhƣ vậy, trong khuôn khổ nghiên cứu này chƣa thấy sự tồn tại đột biến kháng ngã gục ở An. dirus tại Việt Nam.
Một cơ chế kháng khác cũng có liên quan đến tính kháng các hóa chất thuộc nhóm pyrethroid là cơ chế kháng trao đổi chất. Cơ chế kháng trao đổi chất không làm thay đổi vật chất di truyền, gen kháng đã có sẵn trong quần thể, khi tiếp xúc với hóa chất một cách thƣờng xuyên dẫn đến chọn lọc gen kháng và các gen này tăng cƣờng hoạt động tạo nhiều enzyme để phân giải chất độc thành chất không độc, hoặc ít độc hơn hay chất dễ đào thải ra khỏi cơ thể. Kỹ thuật RT-PCR nhằm phát hiện kháng trao đổi chất thực chất là định lƣợng phân tử mARN. Cơ chế kháng này với các hóa chất nhóm pyrethroid có thể liên quan với việc tăng cƣờng sự oxi hóa của các enzyme esterase và P450 monooxygenase trong đó P450 monooxygenase đóng vai trò quan trọng hơn. Theo các nghiên cứu trƣớc đây trên nhiều loài côn trùng và đặc biệt trên muỗi
An. gambiae và An. funestus, những loài muỗi truyền bệnh sốt rét chính ở Châu Phi, nhận thấy các gen mã hóa cho cytochrom P450 đóng vai trò quan
101
trọng trong tính kháng hóa chất với các hóa chất nhóm pyrethroid. Gen mã hóa enzyme P450 monooxygenase ở muỗi có thể do nhiều locus gen quy định, 2 trong số đó và là những locus gen đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là CYP6P9 và CYP6P4 [45]. Những nghiên cứu gần đây nhận thấy sự tồn tại của một trong hai locus này thể hiện mức độ hoạt động tăng cƣờng của gen ở chủng kháng cao hơn so với chủng nhạy thƣờng từ 15 đến 25 lần thậm chí có thể lên tới 50 lần là một trong những yếu tố quan trọng quyết định tính kháng hóa chất nhóm pyrethroid ở từng vùng riêng biệt của Châu Phi [45]. Trong nghiên cứu của chúng tôi mức độ tăng cƣờng hoạt động của gen CYP6P9 gấp 9 đến 11 lần ở dòng kháng so với dòng nhạy chứng tỏ tính kháng của muỗi
An. dirus với hóa chất nhóm pyrethroid có thể là kháng trao đổi chất tuy nhiên tính kháng của muỗi ở đây còn thấp và chƣa ổn định.
102
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đặc điểm sinh học và sự đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam:
- Sự phân bố cuả An. dirus giai đoạn hiện nay vẫn là vùng rừng rậm từ Thanh Hóa trở vào phía Nam. Tuy nhiên sự phân bố này mang tính cục bộ hoặc có mật độ thấp khi sinh cảnh rừng bị tàn phá. Ở miền Bắc (tỉnh Bắc Kạn) có mặt một dạng mới thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus mang đặc điểm hình thái cánh trung gian giữa An. dirus
và An. takasagoensis (tạm gọi là dạng Anopheles Bắc Kạn). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- An. dirus s.s. vẫn là một vector truyền bệnh sốt rét chính ở miền Trung Tây Nguyên Việt Nam. Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng tại Phú Yên, Khánh Phú, Quảng Bình và Quảng Trị lần lƣợt là 2,33%, 4,7%, 0,97% ,1,28%. - Nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam có thể tồn tại hai thành
viên là An. dirus và dạng Anopheles Bắc Kạn. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa dạng Anopheles Bắc Kạn với 4 quần thể An. dirus thu thập tại các địa điểm khác nhau dao động từ 0,7280 đến 0,7514 thể hiện dạng này có thể là loài độc lập. Dạng Anopheles Bắc Kạn tạo thành một nhánh riêng biệt trong cây chủng loại phát sinh theo số liệu trình tự gen COI và ND6.
2. Tính kháng hóa chất diệt côn trùng của loài An. dirus ở Việt Nam:
- An. dirus tại Đảo lớn, Côn Đảo, Bà Rịa Vũng Tàu còn nhạy cảm với các hóa chất diệt côn trùng đƣợc thử nghiệm trong nghiên cứu này. An. dirus tại Eachrang, Sơn Hòa, Phú Yên có khả năng kháng với alpha cypermethrin 30mg/m2 và lambda cyhalothrin 0,05%, tỷ lệ chết tƣơng ứng là 92% và 89%.
103
- Nghiên cứu này chƣa phát hiện thấy kháng ngã gục ở An. dirus tại Việt Nam. Tính kháng permethrin của An. dirus có liên quan đến locus gen CYP6P9a và CYP6P9b với sự biểu hiện quá mức của gen lên gấp 9-11 lần.
KIẾN NGHỊ
1. Cần tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn về sinh học, đặc điểm di truyền (Nhiễm sắc thể, ADN…) dạng muỗi Bắc Kạn để định tên loài cho dạng muỗi này.
2. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tính kháng hóa chất của An. dirus
104
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Kohei Takenaka Takano, Ngoc Thi Hong Nguyen, Binh Thi Huong Nguyen, Toshihiko Sunahara, Michio Yasunami, Manh Duc Nguyen and Masahiro Takagi (2010), ''Partial mitochondrial DNA sequences suggest the existence of a cryptic species within the Leucosphyrus group of the genus Anopheles (Diptera: Culicidae), forest malaria vector, in northern Vietnam'', Parasites & vector (3), pp. 41 - 57.
2. Nguyền Thị Hồng Ngọc, Trịnh Đình Đạt, Hồ Đình Trung, Nguyễn Đức Mạnh, Nguyễn Thị Hƣơng Bình (2010), "Cập nhật thông tin nghiên cứu về phân loại và vai trò truyền bệnh sốt rét của Anopheles dirus sensu lato ở Việt Nam", Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng (3), tr. 39 - 43.
3. Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Nguyễn Thị Hƣơng Bình, Hồ Đình Trung, Trịnh Đình Đạt (2012), “Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu tính kháng hóa chất diệt côn trùng của muỗi Anopheles dirus”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng (6), tr. 11 - 21.
4. Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Hồ Đình Trung, Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Hồng Hạnh (2012), “Đánh giá độ nhạy cảm của An. dirus tại thực địa và tạo dòng kháng An. dirus chủng nuôi trong phòng thí nghiệm (Đảo Hải Nam, Trung Quốc) kháng với permethrin”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng (6), tr. 22 - 30.
105
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Vũ Đức Chính, Hồ Đình Trung, Nguyễn Đức Mạnh, Nguyễn Văn Châu (2006), "Kết quả điều tra đa dạng tiết túc Y học tại Côn Đảo", Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng (4), tr. 66 - 74.
2. Trịnh Đình Đạt, Vũ Thị Loan, Tạ Toàn (1993), "Xác định mức độ và đặc điểm di truyền tính kháng thuốc của muỗi Culex quiquefasciatus", Tạp chí di truyền học và ứng dụng (1), tr. 26 - 27.
3. Nguyễn Long Giang, Nguyễn Thị Hoà, Nguyễn Thƣợng Hiền (1996), “Phân bố muỗi Anopheles (Meigen 1818) ở các tỉnh thành phía Nam Việt Nam và độ nhạy cảm của chúng với hoá chất diệt côn trùng”, Tóm lược các đề tài nghiên cứu khoa học 1991-1995 Phân viện Sốt rét - Ký sinh trùng và côn trùng thành phố Hồ Chí Minh, tr.25 - 29.
4. Lê Xuân Hợi (1995), Muỗi Anpheles Meigen 1818 trong quá trình phòng chống vectorở vùng đồi núi có lưu hành bệnh sốt rét thuộc miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ, Đại học Tổng hợp Hà Nội, Hà Nội.
5. Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Trịnh Đình Đạt (1992), “Một số dẫn liệu về tính đa hình di truyền liên quan đến tập tính đốt mồi và trú đậu của An. minimus ở miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Y học dự phòng 2 (36), tr. 299 - 304.
6. Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung (1997), “Nghiên cứu điện di isozyme và di truyền tế bào của An. minimus và An. dirus ở Việt Nam”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương (1991- 1996), tr. 379 - 386.
7. Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung (2002), “Đặc trƣng phân bố và trao đổi các dòng gen (gene flow) của An. minimus và nhóm loài Anopheles leucosphyrus liên quan đến khả năng truyền bệnh của chúng ở Việt Nam”, Báo cáo khoa học hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ tư, tr. 187 - 196.
106 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8. Lê Xuân Hùng (1995), “Đánh giá nhạy cảm của Anopheles maculatus
với hoá chất diệt hiện dùng ở Malaysia”, Thông tin phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng (2), tr. 40 - 46
9. Phạm Thị Khoa (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái học của một số loài muỗi Anopheles Meigen, 1818 (Diptera : Culicidae) và kỹ thuật nhân nuôi chúng trong phòng thí nghiệm, Luận án phó tiến sĩ, Đại học Tổng hợp Hà Nội, Hà Nội.
10. Phạm Thị Khoa (2003), "Một số đặc điểm sinh học của muỗi Anpheles dirus Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà nuôi trong phòng thí nghiệm", Tạp chí phòng chống bệnh Sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng
(4), tr.73-78.
11. Phạm Thị Khoa (2005), "Bổ sung một số đặc điểm sinh học, sinh thái học và hình ảnh bộ nhiễm sắc thể nguyên phân của muỗi An. dirus Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà trong phòng thí nghiệm", Tạp chí phòng chống bệnh Sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng (1), tr. 47 - 53. 12. Ngô Giang Liên, Nguyễn Sơn Hải (2001). "Bằng chứng di truyền tế bào
của loài Anopheles dirus Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà", Thông tin phòng chống bệnh Sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng (3), tr. 61- 65.
13. Nguyễn Đức Mạnh (1988), Khu hệ muỗi Anopheles Meigen (Diptera: Culicidae) và vai trò truyền bệnh của chúng ở Tây Nguyên, Luận án phó tiến sĩ, Trƣờng Đại học Tổng hợp Hà Nội, Hà Nội.
14. Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Nguyễn Thị Hƣơng Bình (2001), “Nghiên cứu các loài đồng hình và vai trò truyền bệnh của muỗi An. maculatus, An. lesteri, An. sp1 (thuộc nhóm loài An.hyrcanus) ở Việt Nam”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương (1996-2000), tr. 388 - 398.
15. Nguyễn Đức Mạnh, Nguyễn Thị Hƣơng Bình, Lê Đức Đào (2006), "Hoàn thiện một số quy trình tách chiết ADN và ứng dụng kỹ thuật ELISA, PCR để đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi An. minimus, An. dirus ở thí điểm Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hòa", Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc chuyên ngành sốt rét- ký sinh trùng, côn trùng, tr. 291- 302.
107
16. Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Nguyễn Thọ Viễn (1991), "Sự có mặt của An. takasagoensis Morlshita, 1946 ở Việt Nam", Báo cáo hội nghị Côn trùng học toàn quốc lần thứ 1,tr. 41- 45.