Kết quả phản ứng PCR thường biến động, thay đổi từ lần này sang lần khác. Nhưng phản ứng Real-Time PCR lại có tính lặp lại rất cao. Nguyên nhân sự khác biệt này là do thời điểm phân tích kết quả. Real-Time PCR phân tích kết quả theo thời gian thật, chu kỳ ngưỡng của phản ứng lại luôn rơi vào pha lũy thừa là pha mà phản ứng xảy ra thuận lợi nhất. Trong khi đó, kết quả của phản ứng PCR thông thường chỉ được phân tích khi phản ứng kết thúc thường là vào pha bão hoàn của phản ứng. Như vậy, bất kỳ một biến đổi nhỏ nào ở pha lũy thừa cũng sẽ dẫn đến những khác biệt rất lớn trong pha bão hòa của phản ứng PCR thông thường.
4.1.7. Thiết bị- Dụng cụ
A. Máy ly tâm thu huyết thanh
C. Máy ly tâm
D. Máy vortex
Hình 4.1: Các loại Miropipette dùng trong Real-Time PCR 4.2. Quy trình thực hiện
Kỹ thuật Real-Time PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặc hiệu cho HCV. Mỗi cặp mồi được thiết kế trong vùng 5’ không mã hóa 5’UTR của bộ gen HCV để nhân bản trình tự mục tiêu có kích thước 95 cặp base. Phản ứng Real-Time PCR còn sử dụng thêm mẫu dò Taqman đặc hiệu cho HCV, được đánh dấu huỳnh quang. Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản sẽ tương ứng với một tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu này sẽ được đầu dò máy ghi nhận. Như vậy số lượng bản sao trình tự mục tiêu HCV tạo ra ở từn thời điểm sẽ được ghi nhân chính xác trong suốt quá trình PCR. Dựa vào một đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản sao xác định, có thể tính được số lượng bản sao HCV xác định, có thể tính được số lượng bản sao hiện diện trong mẫu ban đầu. Quy trình thực hiện gồm 5 bước
4.3. Thuyết minh quy trình
4.3.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu
-Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất. Vì lúc này các thành phần phân tử trong máu là thuần khiết.
-Máu chỉ giữ ở 4o-8oC trong tối đa 4 giờ, sau đó phải tách huyết thanh. Phải thực hiện liền nếu không sẽ xảy hiện tượng máu bị ngoại nhiễm từ môi trường xung quanh. Thu mẫu Thu nhận RNA Thực hiện Real- Time PCR Phân tích kết quả Tách chiết RNA Thực hiện RT
-Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. -Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút.
-Thu khoảng 0.5ml huyết thanh chuyển vào tube 1.5ml vô trùng. -Giữ tube huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm. 4.3.2. Thu nhận RNA
Việc tách chiết RNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa RNA. Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Việc tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
Các chất trong tách chiết: (1) thành phần có phenol, guianidine thyocianat là những chất làm biến tính protein mạnh , khi xử lí với hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein…(2) chloroform: thường đi kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol, chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol. Sau khi ly tâm, mẫu xử lí với Trizol sẽ tách thành hai lớp: Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa RNA (khi Trizol có pH 4.0), phần protein bị biến tính sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ. RNA trong phần dịch nổi được thu nhận bằng cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ tủa. Chất trợ tủa này là một polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt được các phân tử RNA, nhưng không gây ức chế phản ứng PCR. Sau khi tủa, tủa sẽ được rửa lại 1 lần nữa với ethanol 70% và cuối cùng sẽ được bảo quản trong nước cất đã qua xử lý bằng DEPC, bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
4.3.3. Quy trình thực hiện
-Cho 200µl mẫu (huyết thanh) vào 1 eppendorf có sẵn 900µl dung dịch 1, vortex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
-Thu 600µl dịch nổi có chứa RNA vào 1 eppendorf sạch đã có sẵn 600µl dung dịch 3. Trộn đều, để yên 10 phút. Thêm 200µl dung dịch 2. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
-Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh. Cho từ từ 900µl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
-Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60oC, 10 phút. Cho vào 50µl dung dịch 5. 4.3.4. Thực hiện phản ứng RT
-Thực hiện bước này với các tube RT-Mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang
tan.
-Trước và sau khi đặt phản ứng RT phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới
đáy tube.
-Đánh dấu các tube bằng k ý hiệu mẫu. Cho 15µl chứng (+), chứng (-) hoặc dịch RNA tách chiết vào tube. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm và chuyển ngay
các tube vào máy PCR.
-Lập chương trình cho máy PCR hoạt động: 25oC – 5’, 42oC – 30’, 85oC – 5’, giữ ở 4oC. Chọn chức năng chờ đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt
mới bắt đầu.
-Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng PCR/real-time PCR.
-Nếu chưa thực hiện phản ứng PCR/real-time PCR ngay phải bảo quản cDNA ở - 20oC.
4.4.5. Thực hiện phản ứng Real-time PCR
-Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang
tan.
-Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.
-Cho 2.5µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào tube HCV qPCR mix. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm và chuyển ngay các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard.
-Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc real-time ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương
trình real-time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy vi tính đã kết nối với nhau. Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt bắt đầu.
-Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
-Với standard: chọn loại mẫu là và khai báo nồng độ tương ứng với từng standard. -Với mẫu: chọn loại mẫu là không biết, đặt tên hoặc số tương ứng với ký hiệu của mẫu.
-Màu “Fam”: phát hiện trình tự mục tiêu HCV, màu “Hex”: phát hiện trình tự chứng nội.
-Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR hoạt động: 1 chu kỳ: 95oC-5’, 40 chu kỳ: 95oC-15’’, 60o-1’ (chọn đọc kết quả ở bước này). Chọn chức năng chờ cho đến khi đạt 105o thì chương trình luân nhiệt bắt đầu.
-Lưu file dữ liệu vào máy tính. Nên chọn lưu ở phân vùng ổ cứng không cài hệ điều hành.
Hình 4.2: Quá trình luân nhiệt ( Nguồn: công ty Việt Á, 2011) 4.4. Đọc và giải thích kết quả
PHÂN TÍCH KẾT QUẢ:
Sau khi kết thúc quá trình Real-Time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích. Tùy loại máy có thể phân tích ở dạng “Linear” hoặc dạng “Log” hoặc cả hai.
Phân tích chứng dương và chứng âm: Chỉ chọn giếng và âm , chọn màu FAM rồi đến màu HEX. Thí nghiệm đạt yêu và chuyển sang bước phân tích kết quả
nếu chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt qua tín hiệu nền ( đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền ( đường biểu diễn âm tính ), chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tính hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính. Những trường hợp khác sự cố-nguyên nhân-khắc phục.
Phân tích mẫu: Chọn màu FAM. Có thể phân tích đồ thị ở chế độ đã xử lý hoặc chế độ dữ liệu thô. Nên chọn từng mẫu và phân tích chế độ dữ liệu để có kết quả chính xác nhất. Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận mẫu dương tính. Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “mẫu dương tính dưới ngưỡng phát hiện”. Mẫu có đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thự hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng. Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “ không tìm thấy virus trong mẫu”. Những trường hợp khác sự cố-nguyên nhân-khắc phục. In đồ thị kết quả: Chọn chứng âm chứng nội và mẫu in đồ thị. Copy đồ thị vào trang trả kết quả, chú thích các đường biểu diễn “ chứng âm”, “ chứng nội”, “mẫu”
Biểu đồ 4.9: Biểu đồ đường chuẩn ( Nguồn: công ty Việt Á, 2011)
Qua biểu đồ đường chuẩn ta thấy E=103.9% (nằm trong khoảng 90-105%), R2=1.000 và độ dốc (slope) của đường biểu diễn là -3.232. Có thể kết luận đây là biểu đồ chuẩn lý tưởng.
Sau khi đã có đường chuẩn ta sẽ xác định được lượng copies HBV-DNA trong 1ml huyết thanh.
Kết quả của quá trình Real-time PCR gồm: một mẫu thử nghiệm và một chứng âm.
Bảng 4.1. Kết quả thể hiện quy trình Real-Time PCR
Giếng Tên giếng Màu của
mẫu dò Ct(dR)
Quantity
(copies) Copies/ml
B10 HBV FAM 28,46 4,83E+02 7,25E+04
Hình 4.10: Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm (Nguồn: công ty Việt Á, 2011)
Phân tích đồ thị
-Mẫu dương tính khi đường biểu diễn vượt qua tín hiệu nền. -Mẫu âm tính khi mẫu không vượt qua được tín hiệu nền. -Mẫu nội tại dùng để kiểm tra mẫu có bị ức chế không.
Các trường hợp xảy ra trong quá trình thực hiện phản ứng: TH1: Tất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm.
- Nguyên nhân1: Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ từ môi trường của khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu.
-Biện pháp khắc phục: Tiến hành lại thí nghiệm cẩn thận. Chiếu UV và vệ sinh khu vực thao bằng nước Javel để khử nhiễm.
TH2: Tất cả mẫu và chứng nội đều âm tính kể cả chứng dương. - Nguyên nhân: máy bị hư,
-Biện pháp khắc phục: sửa hoặc thay máy mới.
TH3: Tất cả mẫu đều âm tính kể cả chứng dương nhưng chứng nội dương tính.
-Nguyên nhân: hóa chất bị hư.
-Biện pháp khắc phục: thay hóa chất mới.
TH4: Chứng dương âm, chứng nội trong tube chứng dương dương, các mẫu khác bình thường.
-Nguyên nhân: chứng dương hư
- Biện pháp khắc phục: thay chứng dương mới.
TH5: chứng âm dương, các mẫu khác bình thường, có mẫu âm, có mẫ dương mạnh, dương yếu.
- Nguyên nhân: chứng âm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường từ khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo từ mẫu dương tính.
- Biện pháp khắc phục: thay chứng âm và tiến hành lại thí nghiệm cẩn thận.
TH6: Mẫu và chứng nội đều âm tính. Có mẫu dương tính, có mẫu âm thật sự. -Nguyên nhân: Có thể âm thật sự có thể phản ứng PCR bị ức chế.
- Biện pháp khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần.
TH7: Tất cả các mẫu thí nghiệm trong lô đều bất thường.
-Nguyên nhân: Tube chứa PCR không tương ứng với máy hoặc máy Real-Time bị hư.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN
KẾT LUẬN
Quy trình định lượng HCV bằng kỹ thuật Real-Time PCR cho thấy được ưu điểm về thời gian, độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình khi ứng dụng trên các mẫu huyết thanh.
Đây là kỹ thuật hiện đại được phát triển trong thời gian gần đây, không những cho phép phát hiện mà còn có thể tính toán, xác định được hàm lượng virus có trong mẫu. Tuy nhiên, HCV có nhiều type và nhiều type phụ có khả năng biến đổi cao. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn giúp việc định lượng
được cụ thể đối với mỗi type. Đặc biệt là type 1a và 1b, là 2 type nguy hiểm phổ biến nhưng khả năng điều trị là thấp nhất.
Tài liệu tiếng Việt
[1]. Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2002), Sinh học phân tử (Khái niệm-phương pháp-
ứng dụng), NXB Giáo dục.
[2]. Phạm Hùng Vân. (2009). PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và ứng
dụng thường gặp, NXB Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh.
[3]. Nguyễn Thành Vinh, Nguyễn Hoàng Duy. (2010). Tìm hiểu quy trình phân tích
viêm gan siêu vi C. Báo cáo thực tập.
[4]. Lưu Phương Nam.(2011). Quy trình định lượng HBV bằng phương pháp Real-
time PCR. Báo cáo thực tập tốt nghiệp.
[5] Nguyễn Hữu Chí (1993), bệnh viêm gan siêu vi, NXB ITAXA.
[6] Nguyễn Hữu Chí (1997), viêm gan siêu vi, Bài giảng sau đại học, Đại học y
dược TP.HCM.
[7] Nguyễn Hữu Chí (1998), một số đặc điểm của bệnh viêm gan siêu vi, NXB TP.
HCM.
[8] Đinh Dạ Lý Hương, Bùi Hữu Hoàng, Võ Thị Mỹ Dung, Trần Thiện Tuấn Huy,
Trần Ngọc Bảo (2000), viêm gan siêu vi từ cấu trúc đến điều trị, NXB y học Hà Nội.
[9] Trương Thị Xuân Liên (1994), tình hình nhiễm virus viêm gan C tại TP.HCM
[10] Nguyễn Hoàng Chương (1999) . Bước đầu hình thành quy trình nghi nhiễm
Tài liệu tiếng Anh
[11]. RE Lanford, D Chavez, FV Chisari and C Sureau. (1993). Lack of detection of
negative-strand hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR.
[12]. K K Young, R M Resnick and T W Myers. (1993 April). Detection of
hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription-polymerase chain reaction assay.
[13]. Gary L. Davis M.D, Johnson Y.-N. Lau, Mickie S. Urdea, Paul D. Neuwald, Judith C. Wilber, Karen Lindsay, Robert P. Perrillo, Janice Albrecht. (2005).
Quantitative detection of hepatitis C virus RNA with a solid-phase signal amplification method: Definition of optimal conditions for specimen collection and clinical application in interferon-treated patients.
[14]. J Clin Microbiol, K E Sherman, J O'Brien, A G Gutierrez, S Harrison, M
Urdea, P Neuwald and J Wilber. (1993 October). Quantitative evaluation of
hepatitis C virus RNA in patients with concurrent human immunodeficiency virus infections.
[15]. J Clin Invest, H Lerat, F Berby, M A Trabaud, O Vidalin, M Major, C Trépo,
and G Inchauspé. (1996 February 1). Specific detection of hepatitis C virus minus
strand RNA in hematopoietic cells.
Tài liệu trang web
[16].http://www.hepacentre.com/index.php?option=com_content&view=article&id =202:viem-gan-sieu-vi-c&catid=8:ganmat&Ite
[17]. http://www.drthuthuy.com/faq/tinhhinhscv.html
[19]. http://giangduongykhoa.wordpress.com/2009/02/22/kh%E1%BA%A3-nang- di%E1%BB%81u-tr%E1%BB%8B-virus-viem-gan-sieu-vi-c/