Việc định lượng trong phản ứng Real-Time PCR được thực hiện bằng cách so sánh hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm với hàm lượng sản phảm PCR từ các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết được nhân bản đồng thời. Các thiết bị thực hiện phản ứng Real-Time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng của các mẫu có nồng độ nucleic acid biết trước. Sau đó, nồng độ nucleic acid của các mẫu xét nghiệm sẽ được tính toán dựa trên đường cong chuẩn này. Có nhiều cách để thiết kế một đường cong chuẩn cho một phản ứng Real-Time PCR. Ví dụ, trong phản ứng định lượng virus viêm gan siêu vi B, người ta sử dụng các mẫu huyết thanh có nồng độ virus đã biết dựa vào các phương pháp khác như bDNA hoặc bộ kit HBV Monitor để xây dựng đường cong chuẩn. Người ta cũng có thể tin sạch sản phẩm PCR ( được nhân bản với cặp primer sử dụng cho phản ứng Real-Time PCR) từ gel agarose, đo nồng độ của sản phẩm bằng phương pháp đo mật độ quang, từ đó tính ra số bản sao của sản phẩm để xây dựng đường cong chuẩn. Một phương pháp khác là xây dụng một plasmid chứa trình tự HBV cần nhân bản, tạo dòng và sử dụng các plasmid có nồng độ và số lượng bản sao đã biết để xây dựng đường cong chuẩn. Đối với việc định lượng HCV, người ta cũng sử dụng phương pháp bDNA hoặc bộ kit HCV Monitor để xác định nồng độ virus của các mẫu dùng xây dựng đường cong chuẩn. Một số phương pháp khác
phức tạp hơn là sử dụng một plasmid biểu hiện có chứa trình tự cần nhân bản để tổng hợp RNA. Các RNA được đánh dấu phóng xạ và số lượng phân tử RNA có trong mẫu được xác định bằng phương pháp isotopic tracing. Mẫu có hàm lượng RNA biết trước được dùng để xây dựng đường cong chuẩn cho phản ứng Real-Time PCR.