Việc định lượng số bản sao khuếch đại sẽ dựa vào mẫu dò. Mẫu dò là một đoạn oligonucleotide ngắn xác định, được đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn acid nucleic khác có trình tự bổ sung với nó. Về cơ bản, mẫu dò cũng tương tự như mồi, chỉ khác ở chỗ mẫu dò được gắn thêm một cơ chất có thể phát tín hiệu (thường là đồng vị phóng xạ P32/P33, hoặc chất phát huỳnh quang).
Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-Time PCR với độ nhạy tương đương nhau. Cả bốn phương pháp đều sử dụng các chất nhuộm huỳnh quang, có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi hàm lượng PCR mục tiêu theo thời gian thật của phản ứng. Phương
pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Ba phương pháp còn lại sử dụng các probe có đánh dấu bằng chất huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu.
4.1.3.1. Mẫu dò thủy giải
Còn được gọi là Taqman probe. Mẫu dò này được gắn một chất phát huỳnh
quang ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher. Quencher là một là một phân tử hấp thu năng lượng ở trạng thái bị kích thích. Trong phản ứng PCR, mẫu dò này sẽ
bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi Taq polymerase kéo dài
mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’-3’ exonuclease là loại bỏ các nucleotide ở đầu của mẫu dò và thay bằng nucleotide mới. Khi đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi mẫu dò và phát tín hiệu, còn quencher bị mất tác dụng dập tắt. Ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Taqman probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện. Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp mồi từ 8-10oC
nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải mẫu dò bởi Taq polymerase.
4.1.3.2. Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi
Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Khi ở trạng thái tự do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào DNA mạch đôi thì phát huỳnh quang và cường độ huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR. Các chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I, ethidium bromide. Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào các DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính trong bước biến tính. Mọi DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và phát huỳnh quang nên nếu có các sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác. Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng, người ta xây dựng một đường cong "nóng chảy" (melting curve) bằng cách nâng dần nhiệt độ phản ứng và đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ khác
nhau. Nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA phụ thuộc vào số lượng và thành phần nucleotide. Do đó, dựa vào đường cong "nóng chảy", người ta có thể phát hiện sự hiện diện của các sản phẩm ký sinh và tiến hành các biện pháp khắc phục. Các biện pháp khắc phục rất đa dạng như: thiết kế primer sao cho hiệu quả bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là tối ưu, khảo sát nồng độ các thành phần tham gia phản ứng như Taq polymerase, MgCl2, dNTP… sao cho việc nhân bản là hoàn toàn đặc hiệu.
4.1.3.3. Moleculer Beacon
Đây là loại probe có cấu trúc dạng vòng và cuống trong đó cấu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiêu. Phần cấu trúc dạng prbe của phân tử probe được hình thành từ các lien kết hydro giữa các base bắt cặp bổ sung nằm ở hai đầu mút của probe. Một chất hóa học phát huỳnh quang được gắn vào một đầu của probe và một chất hóa học khác (quencher) có nhiệm vụ “dập tắt” được gắn ở đầu bên kia. Quencher là một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lượng mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang dưới dạng nhiệt và vì thế không cho ánh sáng huỳnh quang nào được phát ra. Trong dung dịch phản ứng, một beacon ở trạng thái tự do sẽ có cấu trúc dạng vòng và cuống. Lúc đó, phần cấu trúc dạng cuốn làm cho hai đầu của probe ở gần với nhau trong không gian; lúc đó quencher sẽ phát huy tác dụng và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang. Khi probe bắt cặp bổ sung với một mạch của trình tự DNA mục tiêu ở nhiệt độ lai của phản ứng thì probe mất cấu trúc dạng vòng và cuốn trở thành dạng thẳng. Điều này làm gia tăng khoảng cách không gian giữa chất phát huỳnh quang và quencher. Chất phát huỳnh quang lúc đó sẽ phát ánh sáng mà các thiết bị có thể tiếp nhận và phân tích. Nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự DNA thì sự lai giữa beacon và trình tự DNA sẽ không xảy ra và vì thế không có sự phát ánh sáng huỳnh quang. Sở dĩ như vậy là vì, về mặt nhiệt động học sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ở beacon thuận lợi hơn là sự hình thành phân tử lai không hoàn chỉnh. Điều đó giải thích cho tính đặc hiệu cao của beacon.
Khó khăn lớn nhất khi sử dụng probe dạng beacon chính là việc thiết kế probe. Trình tự nucleotide của cất trúc dạng cuống phải được thiết kế sao cho Quencher và chất phát huỳnh quang tiếp xúc với nhau. Nếu không thì một phần ánh
sánh huỳnh quang sẽ được phóng thích một cách không đặc hiệu, làm gia tăng mức độ tín hiệu nền của phản ứng dẫn đến việc đánh giá sai kết quả định lượng. Ngược lại, nếu các lien kết trong cấu trúc dạng cuống của phân tử quá mạnh thì Beacon sẽ khó bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu và tín hiệu huỳnh quang phát ra cũng không phản ánh đúng hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Vì vậy, tìm thế cân bằng giữa một cấu trúc ổn định và khả năng bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là điều quan trọng khi thiết kế một Beacon.
4.1.3.4. Probe đôi
Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Một probe mang ở đầu 3’ chất cho “fluorescein” (fluorescein donor) phát ánh sáng màu xanh và probe thứ hai mang ở đầu 5’ chất nhận “fluorescein” (fluorescein donor). Probe thứ hai này được chặn ở đầu 3’ sao cho Taq polymerase không thể kéo mạch từ đầu này. Ánh sáng huỳnh quang từ chất cho chuyển đến chất nhận thông qua hiệu ứng FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer- sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) và chất nhận sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang có màu đỏ.
Trong dung dịch phản ứng, khi hai chất cho và nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra. Đến bước bắt cặp giữa probe với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai probe sau cho phần đầu của probe này tiếp xúc với phần cuối của probe kia. Khi đó hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được và sẽ được các thiết bị ghi nhận. tương tự như beacon, cường độ ánh sánh huỳnh quang do chất nhận phát ra tỉ lệ thuận với hàm lương sản phẩm PCR có trong phản ứng.
Ưu điểm đáng chú ý của phương pháp này là sự thiết kế probe tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon.