- Đối với gia súc và gia cầm: Trong chăn nuôi cần chú ý đề phòng bệnh tật cho chúng. Phải kiểm tra thú y khi giết súc vật, điều này càng làm tốt thì càng ít có cơ hội bán hoặc xuất ra các loại thịt đã nhiễm Salmonella. Trong khi giết thịt phải đảm bảo tính riêng rẽ, tránh sự lây lan của vi khuẩn, chú ý tới các loại dụng cụ dùng khi giết thịt .
- Trong bảo quản thực phẩm, đảm bảo thời gian cất giữ thực phẩm đã chế biến và các nguyên liệu. Chú ý thịt băm, patê... thịt nghiền mà không ướp lạnh ngay sau đó sẽ tạo điều kiện cho toàn bộ khối nguyên liệu đó nhiễm trùng mau chóng.
- Đun sôi thực phẩm trước khi ăn là biện pháp tốt nhất. Thịt đã ướp lạnh thời gian đun nấu phải kéo dài hơn bình thường, khi đun phải đảm bảo nhiệt độ sôi cả bên trong miếng thịt (ít nhất là 5 phút). Thực phẩm còn thừa, thực phẩm dự trữ phải đun lại trước khi ăn. Với trứng có thể bị nhiễm Salmonella rất sớm ngay khi mới đẻ (trứng vịt, ngan, ngỗng...), vì vậy phải chế biến chín hoàn toàn, tuyệt đối không ăn sống hoặc hồng đào.Bảo đảm vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng, chuột.
- Thực hiện nghiêm ngặt chế độ khám tuyển trước khi vào và khám định kỳ (1 năm/1 lần) đối với người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm nhất là thực phẩm đã nấu chín.
Chương III : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian
- Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Khoa Môi trường và Công nghệ
Sinh học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
- Địa chỉ: 144/24 Điện Biên Phủ, P25, Q. Bình Thạnh, TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu và phát hiện Salmonella trên một số mẫu thịt gà tươi sống trên địa bàn hai quận Phú Nhuận và Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh.
3.3 Vật liệu thí nghiệm
3.3.1 Các dụng cụ và hóa chất tiến hành thí nghiệm
- Kéo cắt mẫu.
- Pipet 1ml, 5ml, 10ml. - Đĩa petri.
- Micropipet 10µl-200µl. - Túi PE vô trùng.
- Que cấy thẳng, que cấy vòng - Cân điện tử.
- Ống nghiệm khử trùng. - Tủ ấm 37oC, 42oC.
- Nồi hấp khử trùng 121oC. - Đèn cồn.
- Quả bóp cao su.
- Chai chịu nhiệt dung tích 500ml, 1000ml. - Gía ống nghiệm inox.
- Tủ cấy. - Bông không thấm. - Que cấy. - Cồn 96o, 70o - Nước cất khử trùng 3.3.2 Các môi trường sử dụng - Môi trường BPW (Ấn Độ) - Môi trường RV (Ấn Độ) - Môi trường XLD (Ấn Độ)
- Môi trường dùng để test sinh hóa : + LDC (Ấn Độ) + Manitol (Ấn Độ) + Urea (Merck) + VP (Ấn Độ) + TSI (Ấn Độ) + Trypton (Ấn Độ)
3.4 Nội dung thực hiện
Thu mẫu tại các địa điểm khảo sát Mẫu thịt gà
Hình 3.1: Nội dung thực hiện thí nghiệm 3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Quy trình phân tích
Hình 3.2: Quy trình phân tích Salmonella trong thí nghiệm 3.5.2 Thuyết minh quy trình
GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành 42 SVTH: Nguyễn Hữu Liêm
Đánh giá các chỉ tiêu
Cảm quan Salmonella
Nhận xét, Kết luận
25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây độ pha loãng 10-1
Đem ủ ở 37oC trong 24 giờ
Lấy 0.1ml canh trường cho vào môi trường RV
Ủ ở 42oC ± 0,5 trong 24 giờ
Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 24 giờ
KL đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD : tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn
lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ
Cấy chuyển vào môi trường test sinh hóa : môi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP
Biểu hiện đặc trưng của Salmonella : trên TSI: Ủ ở 37oC trong 24 giờ
a) Chuẩn bị mẫu.
- Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường PBW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
b) Cấy mẫu.
- Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ.
- Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng của salmonella trên môi trường XLD: tròn, lồi, trong suốt , có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)….
- Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
c) Thử nghiệm khẳng định.
- Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Thực hiện như sau:
• Thử nghiệm trên môi trường TSI:
- Hấp khử trùng môi trường TSI ở 1210C trong 15 phút và phân phối môi trường vào các ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng.
- Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của giống thuần sâu vào đáy của ống thạch nghiêng.
- Sau khi cấy xong thì ủ ở 370C trong vòng 24h – 48h.
- Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI
phần nghiêng của môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.
- Salmonella có khả năng H2S xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường TSI.
- Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm.
• Thử nghiệm Urea Broth:
- Cấy VSV vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là bromocresol purple
- Ủ ở 370C trong khoảng 12h – 18h
- Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu vàng. - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu.
Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi
trường. Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím.
Positive Negative
Hình 3.4: Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI Negative
• Lên men mannitol:
- Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8.
- Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định. - Ủ 370C trong 18 – 24h.
- Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi
- Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng. - Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống Durnham.
Môi trường sau khi nuôi cấy salmonella bị acid hóa và chuyển thành màu vàng.
Negative Negative Negative
• Thử nghiệm LDC (Lysine Decarboxylase):
- Sử dụng môi trường Falkow.
- Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định. - Chất chỉ thị màu trong môi trường là Bromocresol purple.
- Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục.
- Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng.
Sau khi nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu.
Negative Positive Negative
• Thử nghiệm khả năng sinh Indol:
- Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC.
- Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s
- Quan sát sau vài phút.
- Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen.
- Thử nghiệm (-): không xuất hiện vòng đỏ.
Negative
• Thử nghiệm Voges – Proskauer:
- Cấy vi sinh vật vào trong môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth)
- Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng từ 2-5 ngày
- Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1.
- Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.
- Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng trên mặt môi trường. - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu.
Negative Negative
Positive
3.4.5. Nhận định tính sinh hoá đặc hiệu:
Tính chất sinh hoá Dương hoặc âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella
TSI lactose - 99,2
TSI sucrose - 99,5
TSI glucose + 100
TSI glucose sinh hơi + 91,2
TSI hydro-sulfua + 91,6
Phân giải urê - 100,0
Lên men mannitol +
Phản ứng Indol - 98,2
Phản ứng V.P - 100,0
Bảng 3.1: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25g mẫu
3.6 Kết quả
3.6.1 Kết quả cảm quan
- Về màu sắc, thịt gà có màu đặc trưng, phần thịt hồng, phần mỡ màu vàng tươi và da màu vàng hoặc trắng
- Về mùi, thịt có mùi đặc trưng, không có mùi lạ - Về tính chất, bề mặt thịt có nước, có độ đàn hồi tốt
- Về cảm quan nhìn chung là tốt, thịt nhìn còn tươi, tính chất, màu sắc, mùi vị không có gì lạ. Nhưng đánh giá cảm quan không đủ để xem xét mức độ sạch của thịt
3.6.2 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella
- Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25g
Negative
Hình 3.10 :
Tỷ lệ nhiễm
Salmonella trên các mẫu khảo sát
- Theo bảng trên, mẫu 3 và mẫu 5 đã nhiễm Salmonella với tỷ lệ 33.33%. Việc tạp nhiễm Salmonella có thể do thao tác của người phân phối thịt không hợp vệ sinh, không dùng các dụng cụ bảo hộ. Hoặc cũng có thể thịt bị tạp nhiễm do không khí, vì vệ sinh khu buôn bán cũng có thể là do nhiễm ở trung tâm giết mổ. Hai mẫu nhiễm có thể nói lên tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm ở hai khu vực này là rất thấp, vì tỷ lệ tạp nhiễm trong quy định của TCVN là 0 CFU/25g
- Tóm lại, ba mẫu 1, 2 và 4 âm tính với Salmonella có thể sử dụng được, nhưng cũng phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, vì không chỉ có Salmonella mới gây ra những ca ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, không nhiễm Salmonella không có nghĩa là không nhiễm các vi sinh vật khác.
- Hai mẫu 3 và 5 không thể sử dụng được, cơ sở phân phối cần có biện pháp vệ sinh tốt hơn, đổi khu vực lấy thực phẩm khác để tránh tình trạng lây nhiễm
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
- Sau quá trình nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng Salmonella là một loài vi khuẩn khá nguy hiểm, chúng gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và một số bệnh khác. Đáng nói là loài này thường tạp nhiễm vào thực phẩm, điều này vô cùng nguy hiểm vì theo TCVN, mức độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25 g.
- Mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm tuy trải rộng khắp cả nước, nhưng năng lực kiểm dịch chưa được cao ở các địa phương , nhất là ở các thành phố lớn như Tp. Hồ Chí Minh
4.2 Kiến nghị
- Trong thực nghiệm trên, có một số phần do thời gian quá gấp mà tôi chưa thể thực hiện được
+ Khảo sát tình trạng vi sinh của khu buôn bán
+ Khảo sát qua tình hình giết mổ gia cầm trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh
- Lập các trung tâm kiểm dịch trên địa bàn các quận và yêu cầu thịt trước khi bán cần phải qua kiểm dịch và sử dụng các dụng cụ phân phối hợp vệ sinh
- Nên lập các địa điểm bán thực phẩm tập trung để dễ dàng kiểm tra vệ sinh khu buôn bán. Thường xuyên tổ chức các đợt kiểm tra khu chăn nuôi và giết mổ để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn vi sinh vật trường đại học y Hà Nội (2007), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội.
2. Bộ môn vi sinh vật trường đại học y khoa Huế (2004), bài giảng vi sinh y học. 3. Bộ y tế (2008), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội.
4. Trần Linh Phước (2009), phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục, Hà Nội
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
5. Bibek Ray (2009), FUNDAMENTAL FOOD MICROBIOLOGY, ,Boca Raton London New York Washington, D.C, USA.
6. Camilla Giammarini and Mauro Magnani, Listeriolysin O from Listeria
monocytogenes, Diatheva, Centre for Biotechnology, University of Urbino, Italy
7. Cynthia L.Sears and James B.Kaper (1996), Enteric Bacterial Toxins:
Mechanisms of Action and Linkage to Intestinal Secretion, American Society for
Microbiology
8. FAO and WHO (2009), Salmonella and Campylobacter in chicken meat 9. Jame M.Jay (2000), Modern Food Microbiology