- Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn. Tất cả các thức ăn tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông. Gia cầm có nhiều
Salmonella nhất, tiếp theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa,
chó, ếch, chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn). Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm, chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm.
Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này. Thực phẩm có nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn. Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vi khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm. Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng và sinh sản trong lòng đỏ trứng.
- Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa. Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5. Những sản phẩm có sữa phải được giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu cóSalmonella trong sữa bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn và lây nhiễm sang các sản phẩm khác
2.2.8 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới
2.2.8.1 Trên thế giới
- Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế. Ở Mỹ, tình trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa, trứng, nước trái cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt. Một đợt dịch gần đây ở Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên khắp nước Mỹ
- Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau. Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy. Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây lan vi khuẩn Salmonella từ các sản phẩm xúc xích.Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn 560 tấn xúc xích do nghi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng này đều do Công ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngôn viên của công ty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản
phẩm xúc xích của chúng tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella”. Sự bùng nổ của số ca nhiễm khuẩn Salmonella ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguồn gây bệnh cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị nhiễm khuẩn Salmonella. Các nhân viên điều tra tại bang Washington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele. Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella có trong các mẫu xúc xích của công ty này. Hiện tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này. Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản phẩm xúc xích của Công ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay không. Vì thế, những sản phẩm xúc xích của công ty này bị thu hồi là do kiểm tra bị nhiễm khuẩn Salmonella.
2.2.8.2 Trong nước
- Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn chế. Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa. Hơn nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95% mẫu được giám sát.
2.3 Các phương pháp phát hiện Salmonella
2.3.1 Phương pháp truyền thống
2.3.1.1 Nguyên tắc
- Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy trình bao gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.
Salmonella thường có mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng
hiện diện chung với một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
+ Bước tăng sinh : tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỷ lệ giữa mẫu và môi trường tăng sinh là 1 : 9, tuy nhiên tùy trường hợp mà tỷ lệ này có thể thay đổi
+ Bước tăng sinh chọn lọc : Các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (TT )… Các nghiên cứu gần đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi trường khác để phân tích nhiều mẫu khác nhau. Tuy vậy, môi trường TT thường được dùng để phân tích các mẫu thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm cao, các mẫu thức ăn gia súc… Hiện nay người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu.
+ Bước phân lập : nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các giống của nhóm này dựa trên một vài đặc tính. Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là môi trường XLD được khuyến khích sử dụng
+ Bước khẳng định : nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến khích sử dụng là KIA/TSI, indol, LDC (Lysine decarboxylase), ODC ( Ornithine decarboxylase ), urea, manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O và H đa giá.
- Môi trường và hóa chất
+ Buffered Pepton Water (BPW)
+ Rappaport Vassiliadis Soya Pepton (RV) + Malachite Green Magnesium Chloride + Tetrethionate Muller – Kauffmanm + Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) + Hektoen Entric Agar (HE)
+ Bismuth Sulphite Agar (BS)
+ Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) + Triple Sugar Iron (TSI)
+ Urea
+ Lysine Decarboxylase + Ornithine Decarboxylase + Manitol
+ Sorbitol + Tryptone
+ Thuốc thử Kovac’s
+ Kháng huyết thanh Salmonella đa giá
2.3.1.2 Phương pháp thực hiện a) Tăng sinh a) Tăng sinh
- Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Đối với một số loại mẫu có chứa các chất gây độc hoặc ức chế sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trình đặc biệt
+ Đối với thịt gia cầm tươi sống : Đặt gia cầm vào một túi PE lớn, cho them 1 lít BPW, lắc bằng máy lắc 30 giây để môi trường thấm vào toàn bộ mẫu
+ Đối với mẫu sữa khô : Cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, cho thêm 225ml BPW, để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút. Sau đó lắc cho tan hoàn toàn
+ Đối với các mẫu gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị : đồng nhất mẫu với tỷ lệ 1/100 trong BPW ( thay vì 1/10 như bình thường ) trước khi tăng sinh. Biện pháp này nhằm giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh
+ Đối với các loại mẫu như casein, phomat, bơ và các sản phẩm tương tự khác : thực hiện dồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 400C
+ Đối với các sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim Milk Broth được làm ấm đến 400C
+ Đối với dừa, các sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng nhất mẫu trong môi trường BPW, sau đó cho thêm 2 – 3 giọt Triton X – 100 trước khi ủ tăng sinh
b) Tăng sinh chọn lọc
+ Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV đã được ủ ấm đến 420C. Ủ ở 420C trong 18 – 24 giờ, khi cần thiết có thể kéo dài ủ thêm 24 giờ
+ Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng, mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác. Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc
khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau
c) Phân lập và nhận diện
+ Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng tất cả các dòng Salmonella cần sử dụng ít nhất hai loại môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau
+ Môi trường XLD: khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng
Hình 2.4: Khẩn lạc đặc trưng của
Salmonella trên môi trường XLD
+ Môi trường
HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ
xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc
Hình 2.5: Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường HE
+ Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ
Hình 2.6: Khẩn lạc đặc trưng
của Salmonella trên môi trường BS
d) Khẳng định
+ Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường không chọn lọc như TSA. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường này được sử dụng cho các test sinh hóa và huyết thanh
+ Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau
+ Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI): Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường, vì vậy phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các chủng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có các vạch màu đen trong môi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc môi trường bị đẩy lên để lại một khoảng hở dưới đáy ống nghiệm
+ Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường bị kiềm hóa, màu không đổi ( màu tím hay xanh )
+ Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH của môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu
+ Lên men manitol, sorbitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng.
+ Thử nghiệm indol và VP (-)
Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng
H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
LDC LDC Không đổi màu
Urea Urea Không đổ màu
Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hóa,môi trường chuyển sang màu vàng Indol Trypton Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử
Kovac’s
VP VP Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và
KOH 40%
Bảng 2.1: Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hóa
- Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thử nghiệm song song với mẫu đối chứng bằng nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng không ngưng kết với nước muối sinh lý
2.3.2 Phương pháp hiện đại
- Phương pháp truyền thống mất khá nhiều thời gian (5 ngày) để cho ra kết quả, do đó người ta đã phát triển rất nhiều phương pháp thử nhanh để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm và mẫu nước trong thời gian ngắn, từ đó có biện pháp xử lý kịp thời đối với các mẫu nhiễm. Xu hướng sử dụng PCR và IMS thường đượ c sử dụ ng. Phương pháp PCR giúp phát hiện nhanh; tuy nhiên dễ xảy ra hiện tượng âm tính giả, đòi hỏi các thao tác phải thành thạo. Multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian, số lượng mẫu và chi phí; tuy nhiên lại có độ nhạy kém hơn. Người ta đã phát triển thêm phương pháp Real Time PCR từ PCR truyền thống. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, cho kết quả sớm hơn, không cần phải chạy điện di sau phản ứng khuếch đại. Phương pháp miễn dịch từ phân tách là một lựa chọn tốt hơn. Nó có độ nhạy cao (< 104 CFU/ml), thời gian ngắn (thí nghiệm được thực hiện trong 4-5 giờ).
- Bên cạnh những kỹ thuật Sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm người ta c cn kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR
assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm.
2.3.2.1 Phương pháp PCR
- Nguyên tắc : Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.
- Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và môi trường + Thiết bị, dụng cụ
+ Tủ ấm 37oC. + Máy luân nhiệt.
+ Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.