a) Tăng sinh
- Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Đối với một số loại mẫu có chứa các chất gây độc hoặc ức chế sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trình đặc biệt
+ Đối với thịt gia cầm tươi sống : Đặt gia cầm vào một túi PE lớn, cho them 1 lít BPW, lắc bằng máy lắc 30 giây để môi trường thấm vào toàn bộ mẫu
+ Đối với mẫu sữa khô : Cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, cho thêm 225ml BPW, để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút. Sau đó lắc cho tan hoàn toàn
+ Đối với các mẫu gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị : đồng nhất mẫu với tỷ lệ 1/100 trong BPW ( thay vì 1/10 như bình thường ) trước khi tăng sinh. Biện pháp này nhằm giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh
+ Đối với các loại mẫu như casein, phomat, bơ và các sản phẩm tương tự khác : thực hiện dồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 400C
+ Đối với các sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim Milk Broth được làm ấm đến 400C
+ Đối với dừa, các sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng nhất mẫu trong môi trường BPW, sau đó cho thêm 2 – 3 giọt Triton X – 100 trước khi ủ tăng sinh
b) Tăng sinh chọn lọc
+ Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV đã được ủ ấm đến 420C. Ủ ở 420C trong 18 – 24 giờ, khi cần thiết có thể kéo dài ủ thêm 24 giờ
+ Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng, mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác. Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc
khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau
c) Phân lập và nhận diện
+ Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng tất cả các dòng Salmonella cần sử dụng ít nhất hai loại môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau
+ Môi trường XLD: khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng
Hình 2.4: Khẩn lạc đặc trưng của
Salmonella trên môi trường XLD
+ Môi trường
HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ
xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc
Hình 2.5: Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường HE
+ Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ
Hình 2.6: Khẩn lạc đặc trưng
của Salmonella trên môi trường BS
d) Khẳng định
+ Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường không chọn lọc như TSA. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường này được sử dụng cho các test sinh hóa và huyết thanh
+ Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau
+ Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI): Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường, vì vậy phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các chủng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có các vạch màu đen trong môi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc môi trường bị đẩy lên để lại một khoảng hở dưới đáy ống nghiệm
+ Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường bị kiềm hóa, màu không đổi ( màu tím hay xanh )
+ Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH của môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu
+ Lên men manitol, sorbitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng.
+ Thử nghiệm indol và VP (-)
Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng
H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
LDC LDC Không đổi màu
Urea Urea Không đổ màu
Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hóa,môi trường chuyển sang màu vàng Indol Trypton Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử
Kovac’s
VP VP Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và
KOH 40%
Bảng 2.1: Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hóa
- Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thử nghiệm song song với mẫu đối chứng bằng nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng không ngưng kết với nước muối sinh lý