bệnh lở cổ rễ trong phòng thí nghiệm
2.3.2.1. Phương pháp thu thập mẫu bệnh
Chọn ruộng cây trồng cạn thuộc các họ thực vật khác nhau như: họ ñậu, họ hoa thập tự, họ cà, họ bầu bí, họ cúc... ñang ở giai ñoạn cây con, quan sát và thu thập những cây có triệu chứng ñiển hình của bệnh lở cổ rễ. Tất cả
những mẫu thu thập ñược ñều ghi rõ tên mẫu cây trồng, ngày ñiều tra và ñịa
ñiểm thu mẫu.
2.3.2.2. Phân lập và giám ñịnh nấm Rhizoctonia solani Kühn * Phương pháp phân lập nấm Rhizoctonia solani Kühn
Sau khi thu thập mẫu ñiển hình từ ñồng ruộng, tiến hành rửa sạch mẫu bệnh, sau ñó rửa lại bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng. Cắt mô bệnh ở phần giáp ranh giữa mô bệnh và mô khỏe ñường kính 1-2 mm. Sau ñó dùng que cấy ñã khử trùng cấy mô bệnh vào môi trường WA ñể ởñiều kiện nhiệt ñộ khoảng 25-30 oC. Sau khi sợi nấm mọc cách mô bệnh 1-2cm, tiến hành kiểm tra dưới kính hiển vi ñể xác ñịnh nấm gây bệnh và cấy truyền sang môi trường PGA khoảng 2-3 lần ñể tạo nấm thuần và giữ nguồn.
* Phương pháp giám ñịnh nấm Rhizoctonia solani Kühn
ðể giám ñịnh nấm Rhizoctonia solani Kühn, tiến hành dùng kính hiển vi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 19 tạo nhằm xác ñịnh chính xác nguyên nhân gây bệnh.(theo Khetmalas. M.B et al (1984)[33] ).
2.3.2.3. Kỹ thuật cấy truyền nấm
Chọn ñĩa petri có nguồn nấm, tiến hành khử trùng ñột (ñường kính ñột: 5 mm) và que cấy bằng cồn 70o trên ngọn lửa ñèn cồn. Dùng ñột ñã khử trùng cắt phần ñầu sinh trưởng của sợi nấm, sau ñó dùng que cấy ñã khử trùng lấy phần vừa ñột ñặt chính giữa vào hộp lồng petri ñã ñổ môi trường. Cấy thuần nhằm tạo nguồn nấm thuần ñể tiên hành các thí nghiệm trong phòng và tạo nguồn nấm bệnh cho thí nghiệm nhà lưới.
2.3.2.4. Nghiên cứu ñặc ñiểm hình thái của nấm Rhizoctonia solani Kühn
Sau khi phân lập ñược các isolates nấm Rhizoctonia solani, tiến hành cấy truyền các isolates nấm Rhizoctonia solani Kühn trên môi trường nhân tạo ở
cùng một ngưỡng nhiệt ñộ, sau ñó theo dõi sự hình thành tản nấm, màu sắc tản nấm, ñường kính tản nấm, khả năng hình thành hạch, cấu tạo sợi nấm, màu sắc sợi nấm.
2.3.2.5. Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của nấm Rhizoctonia solani Kühn
* Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sự phát triển của các isolates nấm Rhizoctonia solani Kühn: Tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sự phát triển của các isolates nấm Rhizoctonia solani
Kühn sau khi ñã phân lập nguồn nấm thuần trên môi trường PGA. Từ nguồn nấm thuần trên mỗi isolates ñó tiến hành cấy truyền sang môi trường PGA, CGA ở ñiều kiện nhiệt ñộ là 300C, mỗi môi trường nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại là 3
ñĩa petri. Thí nghiệm ñược tiến hành trên cùng ñiều kiện, cùng thời ñiểm.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi và ño ñường kính của tản nấm (mm) sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày nuôi cấy.
* Thí nghiệm xác ñịnh nhóm AG (Anastomosis Groups) của các isolates nấm Rhizoctonia solani Kühn: sau khi phân lập ñược các isolates nấm Rhizoctonia solani Kühn trên môi trường PGA tiến hành lai các cặp isolates từ nguồn các cây ký chủ khác nhau trong cùng một ñĩa petri. Chọn từ mỗi isolate một ñĩa nấm sinh trưởng và phát triển tốt. Sử dụng ñột ñã khử trùng, ñột lấy một miếng thạch có sợi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 20 nấm của một isolate úp xuống ñĩa môi trường mới, ñặt miếng thạch cách mép ñĩa petri 1 cm. Cấy một miếng thạch của một isolate khác ở phía còn lại của ñĩa petri.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự phát triển của hai tản nấm và sựñan xen sợi nấm của từng cặp isolates với nhau, quan sát xem hai tản nấm có hình thành rãnh phân cách hay không. Nếu giữa hai tản nấm hình thành rãnh phân cách thì hai isolates ñó khác nhóm di truyền (AG); còn nếu giữa hai tản nấm không có rãnh phân cách thì hai isolates ñó cùng nhóm di truyền (AG).