2.2.1. Phương pháp sản xuất chế phẩm bào tử nấm Hoạt hóa nấm:
Chủng nấm L. lecanii L439 có độc tính cao với rệp đào Myzus persicae và rệp
ngô Maydis aphis chọn lọc từ những nghiên cứu trƣớc đây, đƣợc bảo quản ở thạch
nghiêng, ở 4oC và trong dung dịch Glycerol 30%, - 20oC đƣợc lấy ra và cấy trên môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar: 1 lít dịch chiết từ 200 g khoai tây, 2% đƣờng glucose, 2% Aga) ở 26 đến 28oC trong 7 đến 10 ngày, bảo quản ở 4o
C.
Lên men lỏng để nhân giống:
Cắt một miếng thạch có chứa nấm (10 x 10 mm2) đã đƣợc nuôi 7 ngày tuổi trên môi trƣờng PDA cấy vào bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml môi trƣờng PDB đậy bằng nút bông và nắp giấy, đƣợc khử trùng ở 121oC trong 20 phút (Potato Dextrose
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
Broth: 1 lít dịch chiết từ 200 g khoai tây, 20 g glucose), pH = 6, ủ trong máy lắc tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28oC.
Lên men rắn:
Gạo lức ngâm trong nƣớc 2 giờ, vớt để ráo nƣớc. Đun sôi nƣớc, đổ gạo vào đun sủi đều, tắt bếp, ngâm khoảng 10 phút để hạt gạo đủ trƣơng nƣớc mà không bị hồ hóa, vớt ra để khô bề mặt hạt gạo. Sau đó gạo luộc đƣợc đƣa vào túi plastic (hoặc khay có nắp đậy) và các bình tam giác 250 ml với khối lƣợng lần lƣợt là 700 g/túi (hoặc 500 g/khay) và 10 g/bình, khử trùng ở 121oC, 1 atm, trong 30 phút. Sau khi để nguội, cơ chất đƣợc tiếp 15% giống 5 ngày tuổi, 10% khoáng Czapek, pH = 6, lên men 12 ngày ở 28o
C. Sau 12 ngày lên men, số lƣợng bào tử đƣợc xác định bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer [38], [107].
Làm khô cơ chất – bào tử sau lên men rắn:
Hỗn hợp cơ chất – bào tử sau lên men đƣợc làm khô ở các điều kiện nhƣ hong khô trong phòng thí nghiệm, trong tủ hút có quạt thông gió, trong bình hút ẩm có chứa vôi sống để làm giảm độ ẩm của hỗn hợp cơ chất – bào tử xuống còn khoảng 10% ], [.
Tách và thu bào tử:
Lấy 1 kg hỗn hợp cơ chất – bào tử đã khô có mật độ bào tử đạt 3,93 x 1011 CFU/g cơ chất để tách bào tử. Sau đó hỗn hợp đƣợc sàng qua 3 lớp khác nhau có kích thƣớc lần lƣợt 710 µm, 180 µm và 75 µm để thu bào tử [37].
Bảo quản bào tử:
Bào tử làm khô còn 5% độ ẩm đƣợc kiểm tra sức sống bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng rắn. Sau đó, bào tử đƣợc phối trộn với các chất phụ gia để bảo quản.
Dạng lỏng: 10% bào tử nấm đã khô trộn với các dung dịch bảo quản gồm: hỗn
hợp (10% sữa gầy, 5% glucose), dầu Do, parafin, dầu Mo80, dầu Mo – chất phụ gia (72% dầu Mo80, 8% AT50, 10% EFW) đựng trong ống falcon có nắp kín, bảo quản ở 4oC và 26oC.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
Dạng bột khô: Bảo quản trong hộp kín có đựng các gói silicagel hút ẩm: 20%
hạt silica gel khô (w/w) gói riêng trong túi vải màn, bột bào tử và silica gel đƣợc đặt trong 2 lớp túi nilon và túi thiếc hút chân không, ở 4oC và 26oC.
Dạng bột tan: 20% bột bào tử trộn với các chất phụ gia dạng bột tan theo tỉ lệ 20% bột bào tử trộn với hỗn hợp phụ gia (5% DW95 – Chất phân tán, 10% DA203W – chất phân tán, 50% Diatom300 – chất độn, 15% Kao – chất độn) đựng trong 2 lớp túi nilon và túi thiếc hút chân không, bảo quản ở 4oC và 26oC. Khả năng sống sót của bào tử đƣợc đánh giá định kỳ sau 1, 3, 6, 9 tháng bảo quản bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng rắn [37], [38], [69].
2.2.2. Phương pháp xác định độ ẩm Độ ẩm tuyệt đối:
Cân 1g mẫu cơ chất – bào tử sau lên men rắn cho vào cốc nung thủy tinh chịu nhiệt có nắp đậy (đã đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 80oC trong 2 giờ), mở nắp và sấy trong tủ sấy ở 105oC, thời gian 2 giờ cho đến khi khối lƣợng chất khô không đổi (đối với các bào tử đã đƣợc tách ra khỏi cơ chất thì sấy ở 80oC trong 48 giờ). Mẫu đƣợc lấy ra để tính% độ ẩm tuyệt đối có trong mẫu thí nghiệm theo công thức [69]
% độ ẩm = Trong đó:
W: Trọng lượng cốc nung và mẫu tươi D: Trọng lượng cốc nung và mẫu khô B: Trọng lượng của cốc nung
Tính độ ẩm trong trong chế phẩm:
M (%) =M1 - M2 Trong đó:
M là% độ ẩm còn lại trong mẫu
M1 là% độ ẩm tuyệt đối trong hỗn hợp bào tử cơ chất sau
lên men rắn
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng 2.2.3. Tối ưu điều kiện lên men rắn
Cơ chất đựng trong bình tam giác 250 ml, khử trùng ở 121oC trong 25 phút, để nguội. Lấy 1 ml giống đƣợc lên men ở dạng lỏng 5 ngày tuổi thêm vào môi trƣờng lên men và trộn đều bằng thìa cán dài vô trùng. Bình đƣợc nút bông và nắp giấy để tránh bị nhiễm và đủ lƣợng ôxi cho nấm phát triển thể sợi và tạo bào tử. Các bình tam giác sau đó đƣợc ủ tĩnh ở các điều kiện khác nhau: nhiệt độ, pH và độ ẩm tƣơng đối trong khoảng thời gian khác nhau, tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm. Trong 3 ngày đầu tiên, sau 12 giờ các bình tam giác đƣợc lắc nhẹ một lần để đảm bảo bên trong môi trƣờng luôn thoáng khí.
Các yếu tố tối ưu bao gồm:
Cơ chất: bột ngô, lõi ngô, gạo lức, cám gạo, bột sắn, bột ngô – lõi ngô (1:1, w/w), cám gạo – lõi ngô (1:1, w/w), bột ngô – cám gạo (1:1, w/w), bột ngô – bột sắn (1:1, w/w), bột sắn – lõi ngô (1:1, w/w), bột sắn – cám gạo (1:1, w/w).
Tỷ lệ cơ chất sau chọn lọc gồm có 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 (w/w). Độ dày cơ chất từ 8 – 26 g trong bình tam giác có thể tích 250 ml.
Độ ẩm 40 – 120% v/w (trong đó v và w lần lƣợt là thể tích nƣớc và khối lƣợng cơ chất) tƣơng đƣơng với độ ẩm từ 23 – 58% của môi trƣờng cơ chất.
pH của môi trƣờng lên men rắn từ 3 – 10 (sử dụng dải pH của các loại đệm citrat, đệm photphate, đệm glycine – NaOH).
Nhiệt độ ủ lên men từ 26 ~ 37oC.
Nguồn nitơ bổ sung vào cơ chất đạt nồng độ cuối cùng 0,5% (w/w) gồm nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ nhƣ bột đậu tƣơng, cao nấm men, ure, peptone, cao thịt, NaNO3, NH4Cl, NH4NO3, NH4SO4 và KNO3.
Muối kim loại bổ sung vào cơ chất đạt nồng độ cuối cùng 0,1% (w/w) nhƣ: MnCl2, MgSO4, FeSO4, Na2CO3, CaCl2 và KH2PO4.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành kế tiếp nhau dựa vào các kết quả chọn lọc từ thí nghiệm trƣớc đó, số lƣợng bào tử nấm sinh ra sau lên men đƣợc xác định bằng buồng đếm hồng cầu.
2.2.4. Phương pháp xác định số lượng và khả năng sống sót của bào tử sau bảo quản.
Xác định số lượng bào tử:
Pha loãng: Cần 1g hỗn hợp cơ chất – bào tử sau lên men rắn 12 ngày (hoặc 1g
chế phẩm dạng bột hoặc 1 ml chế phẩm dạng lỏng) cho vào trong ống falcon, bổ sung 9 ml Tween 80 0,05% ngâm trong 30 phút, thu đƣợc dung dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 và tiếp tục pha loãng đến 10-2. Tiếp tục làm nhƣ vậy đến khi thu đƣợc dung dịch bào tử có độ pha loãng cần thiết (10- n) (Hình 2.1)
Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng bào tử
Đếm bào tử: Bào tử đƣợc đếm trong buồng đếm hồng cầu (Neubauer improved,
Superior Marienfeld, Germany) soi dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Đếm tổng số 5 ô vuông lớn lần lƣợt ở 4 góc và ở chính giữa trong tổng số 25 ô vuông lớn trên buồng đếm hồng cầu neubauer (mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ) (Hình 2.2).
Số lƣợng bào tử đƣợc xác định bằng công thức: A = a.k.5.104.
Trong đó: A – là số lƣợng bào tử có trong 1 gam cơ chất hoặc 1 ml dịch nuôi; a – là số lƣợng bào tử đếm đƣợc trong 5/25 ô vuông lớn của buồng đếm neubauer; k – là hệ số pha loãng; 5 – là tỉ lệ chênh lệch giữa số lƣợng ô vuông lớn đƣợc đếm so với
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
Atổng số ô vuông lớn của buồng đếm neubauer; 104 là hằng số để tính đủ thể tích 1 ml (tổng thể tích của 25 ô vuông lớn trên buồng đếm neubauer là ml).
Hình 2.2. Phƣơng pháp đếm bào tử trên buồng đếm hồng cầu
Phương pháp xác định số lượng bào tử sống sót bằng số khuẩn lạc (CFU/g hoặc CFU/ml):
Lấy 1 g hỗn hợp bào tử bảo quản dạng khô (hoặc 1 ml chế phẩm dạng dầu) pha loãng đến 10- 11
. Hút 0,1 ml ở mỗi nồng độ đã pha loãng cấy trải trên đĩa thạch PDA, ủ ở 28oC, trong 4 ngày, đếm khuẩn lạc để xác định số lƣợng bào tử.
Số khuẩn lạc đƣợc đếm và xác định theo công thức trong bài giảng của Lê Minh Tâm [11]. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel.
2.2.5. Nghiên cứu khả năng diệt rệp hại ngô A. maydis của chế phẩm bào tử nấm L. lecanii L439 lecanii L439
Chuẩn bị chế phẩm:
Công thức phun chế phẩm có sự tham khảo chế phẩm Mycotal (Hà Lan). Dung dịch chế phẩm bao gồm: chất phụ gia (0,05% DW95 – chất giữ ẩm và bám dính; 0,05% DA203W – chất giữ ẩm và phân tán; 0,05% EFW – chất giữ ẩm và phân tán; 0,1% dầu Mo – chất lan tỏa, bám dính; 0,05% tween80 – chất bám dính), bào tử nấm và nƣớc để dung dịch phun có nồng độ 107
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Trong phòng thí nghiệm:
Nuôi rệp ngô: Rệp ngô bắt từ đồng ruộng đƣợc nuôi trên các mảnh lá ngô kích
thƣớc khoảng 10 x 10cm đựng trong các hộp có nắp đậy, dƣới đáy có dải 3 – 4 lớp giấy thấm nƣớc (để độ ẩm tƣơng đối khoảng 85%) giúp cho lá ngô luôn tƣơi và rệp sống bình thƣờng, nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC. Hằng ngày kiểm tra khả năng sống của rệp, thay lá ngô mới và bổ sung độ ẩm (nếu cần). Sau 4 – 5 ngày, khi chúng bắt đầu đẻ con non thì tách những con rệp non ra nuôi riêng ở các hộp khác nhau, mỗi hộp nuôi 25 con để phục vụ cho các thí nghiệm sau này khi chúng đạt kích thƣớc mong muốn.
Phun chế phẩm: Mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần, phun sƣơng bằng bình
xịt, khoảng cách 25 – 30cm.
Các công thức phun: CT1 (dung dịch có nồng độ 107 bào tử/ ml, có chất phụ
gia); CT2 (dung dịch có nồng độ 108 bào tử/ ml, có chất phụ gia); CT3 (dung dịch có nồng độ 5 x 108 bào tử/ ml, có chất phụ gia); CT4 (dung dịch chất phụ gia, không có bào tử) và CT4 (đối chứng không phun. Sau khi phun bào tử lên rệp ngô và đối chứng không phun). Hàng ngày, kiểm tra số lƣợng rệp còn sống sót, rệp mới sinh để tính tỷ lệ rệp chết.
Trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng:
- Xác định nồng độ phun:nồng độ phun 107, 108, 5 x 108 bào tử/ml.
- Xác định số lần phun chế phẩm: 1 lần phun, 2 lần phun và 3 lần phun (các lần
phun cách nhau 7 ngày)
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 5 m2 nhắc lại 3 lần. Gieo ngô trong chậu vại để làm thức ăn nuôi rệp. Khi số lƣợng rệp vừa đủ lớn, tiến hành thả rệp. Khi mật độ rệp từ 10 – 20 con/cây tiến hành phun chế phẩm vời nồng độ và thời điểm phun khác nhau. Điều tra mật độ rệp (con/cây) ở 3,7, 10 ngày sau phun, phƣơng pháp điều tra: theo dõi 5 điểm cố định, mỗi điểm 2 cây.
Phương pháp xử lý số liệu:
Hiệu lực của chế phẩm trên rệp ở trong nhà lƣới và phòng thí nghiêm đƣợc xác định theo công thức Abbott, ở ngoài đồng ruộng theo công thức Henderson – Tilton.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
Công thức Abbott [13]:
E(%) = E (%) : Hiệu lực của thuốc.
C: Số sâu sống ở công thức đối chứng. T: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm.
Công thức Henderson- Tilton [46]:
H(%) = H: Hiệu lực của thuốc
Ta : Số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau khi phun.
Tb: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm trước khi
phun.
Ca: Số sâu sống ở công thức đối chứng sau khi phun.
Cb: Số sâu sống ở công thức đối chứng trước khi phun.
Các giá trị trung bình của các công thức thí nghiệm đƣợc so sánh bằng trắc nghiệm F, t ở mức xác suất p ≤ 95%. Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng các phần mềm EXCEL. 100 . C T C
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu điều kiện lên men rắn sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng L. lecanii
L439
3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất
Trong các nguồn cơ chất đƣợc thử nghiệm, nấm L. lecanii L439 lên men rắn hỗn hợp cám gạo – bột ngô (1:1, w/w) cho năng suất bào tử cao nhất đạt (3,87 ± 0,204) x 108 bào tử/g cơ chất. Với các nguồn cơ chất khác nhƣ: gạo, cám gạo – lõi ngô (1:1, w/w), cám gạo, bột ngô – lõi ngô (1:1, w/w) cho năng xuất thấp hơn, từ (2,69 ± 0,4) x 109 đến 3,02 ± 0,48) x 109 bào tử/g có chất (P < 0,001) (Hình 3.1).
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất tới khả năng sinh bào tử của chủng nấm L.
lecanii L439.
BN (Bột Ngô); LN (Lõi Ngô); BN/LN (Bột ngô/Lõi ngô; 1:1, w/w); CG/BN (Cám gạo/Bột ngô; 1:1, w/w); CG (Cám gạo); CG/LN (Cám gạo/Lõi ngô; 1:1, w/w); BS (Bột sắn); BS/LN (Bột sắn/Lõi ngô; 1:1, w/w); BS/BN (Bột sắn/Bột ngô; 1:1, w/w); G (Gạo) BS/CG (Bột sắn/Cám gạo; 1:1, w/w). 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Số lƣợng bào tử ( x10 9 ) / cơ c hất
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
Kết quả này có sự khác biệt với các nghiên cứu trƣớc đây. Feng và cộng sự (2000) lên men rắn sản xuất bào tử V. lecanii trên môi trƣờng gạo và cám gạo cho năng suất bào tử đạt lần lƣợt là 1,5 x 109
và 1,4 x 109 bào tử/g cơ chất. Vu và cộng sự (2008) sản xuất bào tử chủng L. lecanii 41185 trên môi trƣờng gạo, năng suất đạt từ 5,7 x 109 đến 1,82 x 1010/g cơ chất [36], [108]. Shi và cộng sự (2009) đã lên men sản xuất bào tử nấm Verticillium lecanii CBS 102071 trên cơ chất bã mía với nguồn cung cấp cacbon là bột ngô cho số lƣợng bào tử 1,1 x 1010 bào tử/ Ơg chất khô [98].
Lên men trên các nguồn cơ chất còn lại L. lecanii L439 sản xuất bào tử không cao, do vậy nguồn cơ chất cám gạo – bột ngô (1:1, w/w) đƣợc chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất
Hình 3.2. Ảnh hƣởng tỉ lệ của bột ngô, cám gạo trong cơ chất lên men đến khả năng sản xuất bào tử nấm L. lecanii L439.
BN (Bột Ngô); CG (Cám gạo)
Tỉ lệ thành phần cơ chất làm môi trƣờng lên men rắn có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sản xuất bào tử của chủng nấm L. lecanii L439 (Hình 3.2). Cơ chất cám gạo – bột ngô tỉ lệ (6:4, w/w) có số lƣợng bào tử (1,08 ± 0,08) x 1010/g cơ chất, tỉ lệ 2:8 và tỉ lệ 3:7 cho bào tử thấp nhất ở mức (6,44 ± 1,3) x 109 và (7,11 ± 1,4) x 109 /g cơ chất. Các
10.83 0 2 4 6 8 10 12 14 2 CG: 8 BN 3 CG: 7 BN 4 CG: 6 BN 5 CG: 5 BN 6 CG: 4 BN 7 CG: 3 BN 8 CG: 2BN Số lƣợng bà o tử ( x1 0 9)/g cơ chất Tỉ lệ cám gạo / bột ngô
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng
tỉ lệ còn lại cho số lƣợng bào tử từ (8,5 ± 0,44) x 109 đến (1,01 ± 0,15) x 1010 /g cơ chất (P < 0,01).
Nghiên cứu của Lin và cộng sự (1988), nấm B. brongniartii lên men trên hỗn hợp cơ chất gồm bột vỏ hạt bông, cám lúa mì, bột ngô với tỷ lệ (70: 25:5, w/w/w) cho năng suất đạt 2,9 x 109
bào tử/g cơ chất khô [108]. Tao và cộng sự (1988) lên men sản xuất bảo tử nấm B. bassiana trên hỗn hợp cơ chất gồm 70% cám lúa mì, 25% bột ngô