Các tác giả [37] đã đƣa ra phƣơng pháp huỳnh quang xác định gián tiếp As(III) dựa trên hệ phản ứng I2- fluorescein. Bản thân fluorescein là một chất phát quang mạnh ở bƣớc sóng 516 nm (bƣớc sóng kích thích là 495 nm), I2 phản ứng với fluorescein tạo ra hợp chất huỳnh quang yếu ở bƣớc sóng này. Khi có mặt As(III), As(III) sẽ tác dụng với iot làm giảm lƣợng iot phản ứng với fluorescein, dẫn tới thay đổi lƣợng fluorescein còn lại trong dung dịch. Nhƣ vậy lƣợng asen sẽ tỹ lệ với lƣợng dự fluorescein trong dung dịch.
AsO3- + I2 + H2O → AsO43-
+ 2I- + 2H+ AsH3 + 4I2 + 4H2O → AsO43-
+ 8I- + 11H+
Các tác giả đã nghiên cứu và tìm ra đƣợc những điều kiện tối ƣu cho phép xác định là pH= 6,1 (khoảng pH nghiên cứu 5,7- 7); 0,8 ml I2 20 μl/ml (khoảng nghiên cứu từ 0,5-0,9 ml); 0,8 ml fluorescein 10-4 M (khoảng nghiên cứu từ 0,6- 0,9 ml).
Giới hạn xác định của phƣơng pháp là 0,4 ppb. Nếu coi sai số > 5% mới có ý nghĩa thì các ion K+
, Na+, PO43- không gây ảnh hƣởng, các ion Mg2+, Cl-, I-, Br-, F-, SO42-, CO2-3 gấp 200 lần As(III); As(V), Al3+, Mn2++, Hg2+, Zn2+, Ca2+, Ba2+, Fe3+ gấp 100 lần, Cu2+ gấp 50 lần, CN- gấp 2 lần; Sb3+ và Bi3+ gấp 0,5 lần có ảnh hƣởng. Tuy nhiên CN-
có thể tách bằng chƣng cất, Sb3+ và Bi3+ có thể tách bằng chiết. Mẫu trƣớc khi phân tích đƣợc tách bằng chƣng cất dƣới dạng AsCl3 và làm giàu cách chiết với dung môi benzen. Phƣơng pháp này ứng dụng để xác định As(III) trong nƣớc sông và nƣớc sinh hoạt.
1.2.2.2. Phương pháp dòng chảy - huỳnh quang xác định axit dimethyl arsinic(DMAA) trong thuốc diệt cỏ sử dụng phản ứng quang hóa trực tiếp
Nguyên tắc của phƣơng pháp là dùng peroxidisunfat dƣới bức xạ tử ngoại để oxi hóa DMAA tới asenat. Asenat sinh ra sẽ phản ứng với molipdat sinh ra asenomolipdat. Sau đó chất này sẽ tác dụng với thiamin tạo ra sản phẩm có tính huỳnh quang là thiochrom. Dựa vào cƣờng độ phát quang của thichorom ở bƣớc sóng 440 nm (λ = 375 nm) ta có thể xác định đƣợc nồng độ DMAA, cụ thể: khoảng tuyến tính 0,14- 14 ppm, giới hạn xác định 0,014 ppm, tốc độ phân tích 60 mẫu/hấp thụ. Bằng cách tách và làm giàu với nhựa trao đổi cation Dowex AG 50W- X8 dạng H+ các tác giả có thể xác định đƣợc DMAA trong khoảng nồng độ 5,6- 560 ppb, giới hạn xác định là 0,6 ppb. Phƣơng pháp ứng dụng để xác định DMAA trong nƣớc tƣới và thực vật. [36]
1.2.2.3. Xác định Asen bằng phương pháp huỳnh quang phân tử với hệ thuốc thử murexit – Cr(VI)
Phƣơng pháp dựa trên phản ứng oxi hóa của As(III) với Cr(VI) với xúc tác iot. Lƣợng dƣ Cr(VI) sau phản ứng với As(III) sẽ làm tắt huỳnh quang của murexit trong môi trƣờng axit H2SO4 0,45M. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sóng kích thích và phát xạ lần lƣợt là 336 nm và 424 nm với mẫu trắng; ở 336 nm và 428,8 nm khi có mặt As(III). Bƣớc sóng kích thích và phát xạ
của murexit trong môi trƣờng axit không có Cr(VI) lần lƣợt là 353,6 và 444,8 nm. Phép đo đƣợc lặp lại khi cho thêm As(III) và đo cƣờng độ huỳnh quang sẽ xác định đƣợc nồng độ As(III) theo 2 đƣờng chuẩn:
F = 611 + 816C(μg/ml) ( r = 0,9999 với giới hạn nồng độ từ 5 – 100 ng/ml)
F = 391 + 141C(μg/ml) ( r = 1 với giới hạn nồng độ từ 100 ng/ml – 1 μg/ml)
Để xác định tổng lƣợng As(III) và As(V) có trong mẫu, khử As(V) về As(III) bằng natri metabisulphite, đun nóng 90- 100oC để đuổi lƣợng dƣ chất khử.
Hơn 35 cation, anion và một vài phức đƣợc nghiên cứu và kết luận: với lƣợng dƣ gấp 1000 lần nồng độ As(III) của EDTA, tartrate, sulphate, phosphate, nitrate, clorua, ion kim loại kiềm và kiềm thổ, 500 lần Zn2+
, Cd2+, Ni2+, Co2+, Al3+, 100 lần Mn2+
, Th4+, Cr3+, Os8+, 50 lần Bi3+
, Hg2+ không gây ảnh hƣởng tới phép đo. Khi có mặt của EDTA, lƣợng dƣ Fe3+
, Cu2+ 100 lần không gây ảnh hƣởng. Ảnh hƣởng của Fe2+
đƣợc loại trừ bằng cột trao đổi cation Amberlite IR – 120 và loại Sb3+ bằng kết tủa với antimony pyrogallate. Giới hạn phát hiện là 1,5 ppb. Phƣơng pháp có độ đúng và tin cậy cao đƣợc ứng dụng xác định Asen trong những nền phức tạp, mẫu có nhiều nguyên tố ảnh hƣởng ( hợp kim), mẫu môi trƣờng và sinh học. [33]
1.2.2.4. Phương pháp biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị
Phƣơng pháp dựa trên khả năng đề kháng của vi khuẩn trong môi trƣờng có asen. Biosensor hoạt động tùy thuộc vào nồng độ của asen trong môi trƣờng mà nó tạo ra tín hiệu điện tử tỷ lệ với nồng độ của asen. Phản ứng phát hiện có thể là hoạt động của một enzym hay liên kết của chất phân tích với một kháng thể hay một chất nhận… Các tín hiệu thu đƣợc có thể là tín hiệu quang học hoặc điện hóa tuyến tính với một hay nhiều chất phân tích. Thành
phần quan trọng của vi khuẩn chỉ thị asen là plasmit, trong tế bào vi khuẩn có chứa gen kháng asen tự nhiên và gen chỉ thị, hai đoạn gen này đƣợc nối với nhau cùng hoạt động dƣới sự điều khiển của một promoter. Khi vi khuẩn tiếp xúc với môi trƣờng có chứa asen, asen đƣợc thấm qua màng tế bào vi khuẩn thông qua con đƣờng hấp thụ, vận chuyển tích cực hay thụ động nó sẽ liên kết với protein điều hòa dẫn đến hoạt hóa sự phiên mã của gen chỉ thị. Gen chỉ thị mã hóa tạo ra ezym luciferase xúc tác cho phản ứng phát quang:
n-decanal + FMNH2 + O2 → Axit decanoic + FMN + hv
Phản ứng phát sáng của luciferase vi khuẩn bao gồm sự oxy hóa khử monolucleotit flavin và 1 aldehyt chuỗi dài làm cơ chất để phản ứng với ezym và kết quả là sản sinh ra ánh sáng màu xanh ở bƣớc sóng 490 nm. [32]
Kết luận: Căn cứ vào các tài liệu tham khảo đƣợc, để việc xác định asen đơn giản, có khả năng khả thi trong các phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phƣơng pháp xác định asen bằng phƣơng pháp trắc quang với thuốc thử Safranin.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên tắc của phương pháp trắc quang xác định hàm lượng asen bằng Safranin.
Safranin T (Tolusafranin; 3,6- diamino- 2,7- dimetyl-10 phenyl phenazin clohidrat (I); 3- 6- diamino- 2,7- dimetylphenazin (II)).
N+ N CH3 NH2 H3C H2N Cl- (I) M=350,8 N+ N CH3 NH2 H3C H2N Cl- (II) M=364,9 CH3
Safranin T là hỗn hợp của hai chất I và II
Safranin T là chất bột màu đỏ, rất độc, tan trong nƣớc cho dung dịch màu đỏ [2]. Dung dịch trong rƣợu etylic có màu đỏ, phát huỳnh quang màu đỏ vàng. Trong dung dịch rƣợu etylic hấp thụ cực đại với ánh sáng có λ = 539 và 503,2 nm
Phản ứng:
- Khi thêm HCl đặc vào dung dịch safranin trong nƣớc sẽ đƣợc dung dịch có màu tím xanh.
- Safranin tác dụng với NaOH sẽ tạo kết tủa màu đỏ nâu
- Trong dung dịch H2SO4 đặc cho dung dịch màu xanh lá cây, pha loãng dung dịch bằng nƣớc thì dung dịch sẽ chuyển thành xanh sau đó có màu đỏ.
Safranin là chất chỉ thị oxi hóa khử (có Eo = 0,289 V), khi bị oxi hóa thì nó tạo sản phẩm không màu
Sự làm mất màu của safranin khi có mặt iodate trong môi trƣờng axit xảy ra theo cơ chế nhƣ sau [21]:
+ As(III) phản ứng với KIO3 trong môi trƣờng axit để giải phóng ra I2 theo phản ứng:
2AsO2- + 2IO3- + 2H+ → 2AsO3- +I2 + 4H2O
+ I2 sinh ra sẽ oxi hóa làm mất màu thuốc thử safranin tạo ra sản phẩm không màu: N+ N CH3 NH2 H3C H2N I2,H+ N H N CH3 NH2 H3C H2N
Màu đỏ không màu
Vì vậy, bằng cách theo dõi sự giảm độ hấp thụ quang của Safranin theo nồng độ As(III) thì có thể định lƣợng đƣợc As(III) trong mẫu theo phƣơng pháp thời gian ấn định hoặc phƣơng pháp tg.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu của luận văn gồm:
- Tối ƣu hóa các điều kiện của phép xác định gồm nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố sau đến phản ứng chỉ thị:
+ Phổ hấp thụ của dung dịch chất màu và chọn cực đại hấp thụ để đo độ hấp thụ quang.
+ Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng. Theo dõi biến thiên tốc độ phản ứng để chọn phƣơng pháp tg hay phƣơng pháp thời gian ấn định.
+ Ảnh hƣởng của nồng độ đầu các tác nhân phản ứng nhƣ KIO3, Safranine đến tốc độ phản ứng.
+ Ảnh hƣởng của môi trƣờng phản ứng .
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của các ion lạ đến phép xác định.
- Đánh giá phƣơng pháp phân tích : gồm khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng, khoảng tuyến tính; đánh giá độ chụm và độ chính xác của phƣơng pháp phân tích, tính hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phân tích.
- Xây dựng qui trình phân tích và ứng dụng phân tích mẫu thực tế.
2.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị
* Bình định mức thủy tinh loại A có dung tích 25, 50, 100, 250, 500 ml. * Cốc thuỷ tinh chịu nhiệt dung tích 100, 250 ml.
* Bình nón dung tích 250 ml, buret 25 ml.
* Các loại pipet chia vạch: 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 25 ml.
* Máy trắc quang UV - VIS 1601 PC - Shimadzu (Nhật Bản), bƣớc sóng làm việc tử 190- 900 nm , cuvet thủy tinh chiều dày l = 1cm.
* Cân phân tích Scientech SA 210 độ chính xác 0,0001g. * Máy điều nhiệt.
* Đồng hồ bấm giờ. * Máy đo pH.
2.2.2. Hóa chất
Các hóa chất cần dùng là loại tinh khiết phân tích (p.a. và tinh khiết thuốc thử (p.R.). Các dung dịch đƣợc pha chế bằng nƣớc cất hai lần.
Pha các dung dịch tiêu chuẩn:
+ Pha 100,00 ml As(III) 1000ppm từ từ As2O3 tinh thể
Cân chính xác 0,1320 gam As2O3 tinh thể trên cân phân tích, hòa tan lƣợng cân này bằng dung dịch NaOH loãng, sau đó đun nóng dung dịch cho As2O3 tan
hết, chuyển vào bình định mức 100,00 ml, tráng rửa cốc cân vài lần bằng nƣớc cất hai lần rồi chuyển vào bình định mức trên, thêm nƣớc cất tới vạch mức, sóc trộn đều dung dịch ta đƣợc 100,00 ml dung dịch As(III) 1000ppm.
+ Thiết lập lại nồng độ As(III) bằng dung dịch Iot tiêu chuẩn
- Pha 100,00 ml dung dịch I2 0,0127 M từ Iot tinh thể
Cân 0,32g Iot trên cân kỹ thuật. Hòa tan sơ bộ lƣợng cân này bằng nƣớc cất, sau khi iot tan hết thêm khoảng 10g KI. Thêm nƣớc cất tới vạch mức, sóc trộn đều dung dịch đƣợc dung dịch I2 có nồng độ sấp sỉ 0,0127 M. Dung dịch vừa pha bảo quản trong chai thủy tinh màu nút nhám.
- Pha 100,00 ml dung dịch Na2S2O3 0,025M từ Na2S2O3 tinh thể
Cân 0,62g Natri thiosunfat trên cân kỹ thuật, hòa tan sơ bộ bằng nƣớc cất, chuyển vào bình dịnh mức 100,00 ml, tráng rửa cốc cân, thêm nƣớc cất tới vạch mức đƣợc 100,00 ml dung dịch Na2S2O3 có nồng độ sấp sỉ 0,025 M.
- Pha 100,00 ml dung dịch K2Cr2O7 4,17x10-3M
Cân chính xác 0,12270,0001g Kali dicromat loại tinh khiết hóa học trên cân phân tích, hòa tan sơ bộ bằng nƣớc cất chuyển vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc cân nhiều lần chuyển vào bình trên, thêm nƣớc cất đến vạch mức, sóc trộn đều dung dịch đƣợc 100,00 ml dung dịch K2Cr2O7 4,17x10-3M.
- Thiết lập lại nồng độ dung dịch Na2S2O3 theo K2Cr2O7
Phƣơngtrình chuẩn độ:
K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 Cr2(SO4)3 + 3I2 + 4 K2SO4 + 7H2O I2 + 2Na2S2O3 htb 2NaI + Na2S4O6
Hút chính xác 10,00ml dung dịch K2Cr2O7 4,17x10-3M vừa pha vào bình nón nút mài, thêm 10,0ml KI 10%; 5,0ml H2SO4 ½, pha loãng dung dịch bằng nƣớc cất tới khoảng 150,0 ml. Để bóng tối 5 phút, lấy ra đem chuẩn bằng dung dịch Na2S2O3 vừa pha tới màu vàng nhạt, thêm khoảng 1,0 ml hồ tinh
bột chuẩn đền mất màu xanh. Làm thí nghiệm song song, sai số giữa hai lần chuẩn không quá 0,1ml.
- Thiết lập lại nồng độ dung dịch I2 theo Na2S2O3
Phƣơng trình chuẩn độ:
I2 + 2Na2S2O3 htb 2NaI + Na2S4O6
Hút chính xác 10,00 ml dung dịch I2 vào bình nón, thêm một lƣợng nhỏ nƣớc cất, đem chuẩn bằng dung dịch Na2S2O3 tới vàng nhạt, thêm 1,0 ml hồ tinh bột 1% chuẩn tiếp tới mất màu xanh. Làm thí nghiệm song song, sai số giữa hai lần chuẩn không quá 0,1ml.
- Thiết lập lại nồng độ dung dịch As(III) bằng I2
Phƣơng trình chuẩn độ:
Na3AsO3 + I2 + H2O Na3AsO4 + 2HI
Hút chính xác 10,00 ml dung dịch asenit vào bình nón 250ml, thêm 2 giọt dung dịch phenolphtalein, dung dịch có màu hồng, thêm từng giọt dung dịch H2SO4 2M cho đến khi mất màu hồng. Cho tiếp vào bình chuẩn độ khoảng 1 gam NaHCO3, lắc đều (nếu dung dịch lại có mầu hồng thì thêm tiếp H2SO4 2M cho tới khi mất màu ). Thêm 1 – 2 ml hồ tinh bột, chuẩn độ mẫu vừa chuẩn bị bằng dung dịch iot cho tới khi xuất hiện màu xanh nhạt. Làm thí nghiệm song song, sai số giữa hai lần chuẩn không quá 0,1ml.
+ Pha 100,00 ml As(III) 100ppm từ dung dịch As(III) 1000ppm
Hút chính xác 10,00 ml dung dịch As(III) 1000ppm chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nƣớc cất tới vạch mức, sóc trộn đều dung dịch ta đƣợc 100,00 ml dung dịch As(III) 100ppm.
+ Pha 100,00 ml As(III) 10ppm từ dung dịch As(III) 1000ppm
Hút chính xác 1,00 ml dung dịch As(III) 1000ppm chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nƣớc cất tới vạch mức, sóc trộn đều dung dịch ta đƣợc 100,00 ml dung dịch As(III) 10ppm.
+ Pha 100,0 ml dung dịch Safranine 0,02 %
Cân 0,02 gam Safranine, hòa tan bằng nƣớc cất tới thể tích 100 ml, khuấy đều ta đƣợc 100,0 ml dung dịch Safranine 0,02 %.
+ Pha 500,0 ml dung dịch HCl 1M
Đong khoảng 42,0 ml dung dịch HCl đặc 37% chuyển vào bình chứa có dung tích 500 ml đã có chứa sẵn 1/3 nƣớc cất, thêm nƣớc cất tới thể tích 500,0 ml, khuấy đều ta đƣợc 500,0 ml dung dịch HCl 1M.
+ Pha 250,0 ml dung dịch KIO3 2%
Cân 5 gam tinh thể KIO3, hòa tan bằng nƣớc cất tới thể tích 250,0 ml, khuấy đều ta đƣợc 250,0 ml dung dịch KIO3 2%.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu phƣơng pháp xác định As (III) dựa trên hệ phản ứng oxi hóa khử As(III), KIO3 và Safranin. ứng oxi hóa khử As(III), KIO3 và Safranin.
3.1.1. Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu của phản ứng chỉ thị
3.1.1.1. Phổ hấp thụ của sản phẩm phản ứng chỉ thị
Chuẩn bị 04 bình định mức dung tích 25 ml, lấy vào 02 bình định mức 3 và 4 các lƣợng As (III) đƣợc lấy từ dung dịch As (III) 100,00 ppm nhƣ sau:
Bình 1-2: mẫu trắng
Bình 3: 1,25 ml dung dịch As (III) 100,00 ppm. Bình 4: 2,50 ml dung dịch As (III) 100,00 ppm.
Thêm vào các bình từ 1- 4 mỗi bình 2,50 ml dung dịch KIO3 2%, thêm vào tất cả các bình, mỗi bình 2,50 ml dung dịch HCl 1M; cuối cùng thêm vào các bình 2, 3 và 4 mỗi bình 1,50 ml dung dịch safranine 0.02 %. Sau đó định mức bằng nƣớc cất đến vạch mức. Sóc trộn đều dung dịch, đem đo độ hấp thụ quang của các dung dịch trong khoảng bƣớc sóng từ 400 – 700 nm với dung dịch so sánh là dung dịch trong bình 1. Kết quả thu đƣợc nhƣ hình 3.1.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ quang của dung dịch Safranine khi có mặt As(III), KIO3, HCl (Nồng độ cuối của các tác nhân trong dung dịch lần lượt là: Safranine
Đƣờng 1: Phổ hấp thụ của dung dịch có Safranine, KIO3, HCl
Đƣờng 2: Phổ hấp thụ của dung dịch có As(III) 5ppm,Safranine, KIO3, HCl Đƣờng 3: Phổ hấp thụ của dung dịch có As(III) 10ppm, Safranine, KIO3, HCl Safranine là thuốc thử có màu đỏ, có bƣớc sóng hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng λ = 519 nm trong môi trƣờng axit mạnh (đƣờng 1). Khi giữ nguyên nồng độ KIO3 2% và cho thêm As (III) với nồng độ khác nhau 5,0 ppm (đƣờng 2), As (III) 10,0 ppm (đƣờng 3) thì thực nghiệm cho thấy, càng tăng nồng độ của As (III) thì độ hấp thụ quang A của dung dịch phản ứng càng giảm mà không làm chuyển dịch cực đại. Điều đó chứng tỏ khi có As(III) và khi nồng độ As(III) càng lớn thì phản ứng giữa As(III) và KIO3 trong môi trƣờng axit xảy ra càng triệt để, giải phóng ra càng nhiều I2 và I2 oxi hóa safranin tạo ra sản