Các tác giả [27] đã nói về một số ứng dụng trong phân tích huỳnh quang của hệ Ce(IV)/Ce(III) nhƣ xác định As(III), Ce(IV), Fe(II), oxalat, I2, … Cơ sở xác định As(III) dựa trên phản ứng:
Theo phƣơng trình cứ 1 phân tử As(III) phản ứng với Ce(IV) tạo 2 phân tử Ce(III). Phản ứng xảy ra chậm ở điều kiện thƣờng nhƣng khi có mặt OsO4 phản ứng xảy ra nhanh hơn, As(III), Ce(IV), As(V) không có tính chất phát quang. Riêng Ce(III) là một trong số ít những ion có tính chất phát quang ở bƣớc sóng 350 nm khi bị kích thích ở bƣớc sóng 260 nm. Đƣờng chuẩn xác định As(III) đƣợc xây dựng trong khoảng nồng độ 0,07- 0,4 ppm. Các yếu tố gây ảnh hƣởng cũng đã đƣợc nghiên cứu: các ion NO3-
, Fe3+ gây ảnh hƣởng do chúng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm hoặc 350 nm làm giảm cƣờng độ huỳnh quang. Các cation Hg(I), Sn(II), Ti(III), V(IV) cũng cho phản ứng tƣơng tự nhƣ As(III) làm tăng lƣợng Ce(III) sinh ra, do đó cƣờng độ huỳnh quang tăng lên. Citrat, tatrat, EDTA tạo phức với Ce(IV) gây cản trở phép xác định. Với lƣợng mol gấp 200 lần As(III), các catrion Al3+
, Be2+, Ca2+, Cd2+, Cu2+, K+, Na+, Mg2+, NH4+, Ni2+,Sr2+, Zn2+ và một số nguyên tố đất hiếm không ảnh hƣởng đến hệ ở nhiệt độ phòng.
1.2.1.8. Phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS)
Ngày nay phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rất phổ biến để phân tích hàm lƣợng các kim loại nặng trong các đối tƣợng khác nhau: nƣớc sinh hoạt, nƣớc thải, hoa quả, thực phẩm… Phƣơng pháp này đơn giản, có độ nhạy và độ chính xác cao, trang bị của nó không quá cồng kềnh, thích hợp cho việc phân tích hàng loạt.
Phƣơng pháp AAS là phƣơng pháp phổ biến để xác định tổng lƣợng asen có trong mẫu. Phƣơng pháp AAS sử dụng kỹ thuật hyđrat hóa (HG - AAS) có độ nhạy cao, kết quả phân tích ổn định và loại đƣợc nhiều ảnh hƣởng của matrix vốn thƣờng rất phức tạp. Phƣơng pháp này cho phép xác định asen ở hàm lƣợng thấp (vài ppb) mà không cần làm giàu. Muốn xác định riêng lẻ As(III) và As(V) ngƣời ta dựa vào khả năng khử khác nhau của As(III) và As(V) đối với NaBF4 ở các pH khác nhau. Quá trình khử ở pH từ 0 đến 7 của
As(III) là dễ hơn As(V). As(V) chỉ bị khử trong môi trƣờng có nồng độ axit lớn. Ngƣời ta tiến hành hydrua hóa trƣớc khi nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa đèn khí. Mẫu sau khi vô cơ hóa đƣợc khử thành asin bằng NaBF4 trong môi trƣờng HCl sau đó đƣợc dẫn vào ống thạch anh đặt ở vùng ổn định ngọn lửa đèn khí. Khí AsH3 tạo thành đƣợc đo ở bƣớc sóng λ = 197,3 nm. Tuy nhiên nếu có một lƣợng dƣ các nguyên tố: Sb, Sn, Bi, Hg, Se, Te… sẽ gây trở ngại cho việc xác định asen bằng phƣơng pháp này do chúng có thể bay hơi trong điều kiện trên. Phƣơng pháp này có độ nhạy với As(III) cao hơn As(V).
Bằng phƣơng pháp này chúng ta có thể xác định tổng As(III) và As(V) trong cùng một dung dịch. As(V) đƣợc khử thành As(III) bằng chất khử thích hợp (KI 20% - Na2SO3 5%, KI 10% - axit ascorbic 5% - HCL 2M…). Nhờ tác dụng của chất khử mạnh NaBF4 toàn bộ As(III) đƣợc chuyển thành khí AsH3 . Khí này đƣợc chuyển tối bộ phận nguyên tử hóa nhờ dòng khí trơ (Ar, N2 hoặc He). Trong bộ phận này khí AsH3 đƣợc nguyên tử hóa thành As ở nhiệt độ 900 – 1000oC, sau đó các nguyên tử As đƣợc đo ở bƣớc sóng λ = 197,3 nm.
Tác giả Lê Tự Thành và cộng sự đã ứng dụng phƣơng pháp HG – AAS để xác định tổng As trong mẫu nghêu đƣợc xử lý bằng hỗn hợp HNO3 + H2O2, kết quả thu đƣợc có độ ổn định cao, hiệu suất thu hồi 92,6 – 105,9 %.
Nguyên tử hóa không ngọn lửa (ETA – AAS) thƣờng dùng một lò nung nhỏ bằng graphit (cuvet graphit) hay thuyền Tatan để nguyên tử hóa mẫu nhờ nguồn năng lƣợng nhiệt của dòng điện có thế thấp (nhỏ hơn 12V) nhƣng có dòng rất cao (50- 800A), cho độ nhạy cao đạt đến 0,1 ppb và đƣợc ứng dụng khá phổ biến hiện nay. Ƣu điểm của kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu này là tiêu tốn rất ít mẫu, chỉ từ 20 50 l. Về nguyên tắc, đây là quá trình nguyên tử hóa tức khắc trong thời gian rất ngắn nhờ năng lƣợng của dòng điện có công suất lớn và trong môi trƣờng khí trơ. Quá trình nguyên tử hóa xảy ra trong vòng từ 60 80 giây, theo bốn giai đoạn tiếp nhau: sấy khô, tro hóa luyện
mẫu, nguyên tử hóa và làm sạch cuvet. Nguồn năng lƣợng thƣờng đƣợc dùng hiện nay là dòng điện có cƣờng độ dòng rất cao (từ 50 600A) và thế thấp (dƣới 12V) hoặc năng lƣợng của dòng cao tẩn cảm ứng. Khi dùng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa độ nhạy của phƣơng pháp tăng lên rất nhiều nhờ hiệu suất nguyên tử hóa cao, tuy nhiên ảnh hƣởng của nền đến cƣờng độ hấp thụ là rất lớn. As trong nƣớc có thể đƣợc định lƣợng trực tiếp hoặc đƣợc tạo hơi asin rồi đƣợc khí mang Ar đƣa vào cuvet graphit [12].
1.2.2. Phương pháp huỳnh quang
Phƣơng pháp huỳnh quang gồm huỳnh quang tia-X, huỳnh quang phân tử, huỳnh quang nguyên tử… Tuy nhiên, huỳnh quang phân tử là phƣơng pháp đƣợc chú ý do khả năng ứng dung rộng rãi, đơn giản, ít tốn kém, độ nhạy và chọn lọc cao, có nhiều nghiên cứu của nhiều tác giả đƣa ra.
1.2.2.1. Xác định As(III) bằng thuốc thử fluorescein
Các tác giả [37] đã đƣa ra phƣơng pháp huỳnh quang xác định gián tiếp As(III) dựa trên hệ phản ứng I2- fluorescein. Bản thân fluorescein là một chất phát quang mạnh ở bƣớc sóng 516 nm (bƣớc sóng kích thích là 495 nm), I2 phản ứng với fluorescein tạo ra hợp chất huỳnh quang yếu ở bƣớc sóng này. Khi có mặt As(III), As(III) sẽ tác dụng với iot làm giảm lƣợng iot phản ứng với fluorescein, dẫn tới thay đổi lƣợng fluorescein còn lại trong dung dịch. Nhƣ vậy lƣợng asen sẽ tỹ lệ với lƣợng dự fluorescein trong dung dịch.
AsO3- + I2 + H2O → AsO43-
+ 2I- + 2H+ AsH3 + 4I2 + 4H2O → AsO43-
+ 8I- + 11H+
Các tác giả đã nghiên cứu và tìm ra đƣợc những điều kiện tối ƣu cho phép xác định là pH= 6,1 (khoảng pH nghiên cứu 5,7- 7); 0,8 ml I2 20 μl/ml (khoảng nghiên cứu từ 0,5-0,9 ml); 0,8 ml fluorescein 10-4 M (khoảng nghiên cứu từ 0,6- 0,9 ml).
Giới hạn xác định của phƣơng pháp là 0,4 ppb. Nếu coi sai số > 5% mới có ý nghĩa thì các ion K+
, Na+, PO43- không gây ảnh hƣởng, các ion Mg2+, Cl-, I-, Br-, F-, SO42-, CO2-3 gấp 200 lần As(III); As(V), Al3+, Mn2++, Hg2+, Zn2+, Ca2+, Ba2+, Fe3+ gấp 100 lần, Cu2+ gấp 50 lần, CN- gấp 2 lần; Sb3+ và Bi3+ gấp 0,5 lần có ảnh hƣởng. Tuy nhiên CN-
có thể tách bằng chƣng cất, Sb3+ và Bi3+ có thể tách bằng chiết. Mẫu trƣớc khi phân tích đƣợc tách bằng chƣng cất dƣới dạng AsCl3 và làm giàu cách chiết với dung môi benzen. Phƣơng pháp này ứng dụng để xác định As(III) trong nƣớc sông và nƣớc sinh hoạt.
1.2.2.2. Phương pháp dòng chảy - huỳnh quang xác định axit dimethyl arsinic(DMAA) trong thuốc diệt cỏ sử dụng phản ứng quang hóa trực tiếp
Nguyên tắc của phƣơng pháp là dùng peroxidisunfat dƣới bức xạ tử ngoại để oxi hóa DMAA tới asenat. Asenat sinh ra sẽ phản ứng với molipdat sinh ra asenomolipdat. Sau đó chất này sẽ tác dụng với thiamin tạo ra sản phẩm có tính huỳnh quang là thiochrom. Dựa vào cƣờng độ phát quang của thichorom ở bƣớc sóng 440 nm (λ = 375 nm) ta có thể xác định đƣợc nồng độ DMAA, cụ thể: khoảng tuyến tính 0,14- 14 ppm, giới hạn xác định 0,014 ppm, tốc độ phân tích 60 mẫu/hấp thụ. Bằng cách tách và làm giàu với nhựa trao đổi cation Dowex AG 50W- X8 dạng H+ các tác giả có thể xác định đƣợc DMAA trong khoảng nồng độ 5,6- 560 ppb, giới hạn xác định là 0,6 ppb. Phƣơng pháp ứng dụng để xác định DMAA trong nƣớc tƣới và thực vật. [36]
1.2.2.3. Xác định Asen bằng phương pháp huỳnh quang phân tử với hệ thuốc thử murexit – Cr(VI)
Phƣơng pháp dựa trên phản ứng oxi hóa của As(III) với Cr(VI) với xúc tác iot. Lƣợng dƣ Cr(VI) sau phản ứng với As(III) sẽ làm tắt huỳnh quang của murexit trong môi trƣờng axit H2SO4 0,45M. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sóng kích thích và phát xạ lần lƣợt là 336 nm và 424 nm với mẫu trắng; ở 336 nm và 428,8 nm khi có mặt As(III). Bƣớc sóng kích thích và phát xạ
của murexit trong môi trƣờng axit không có Cr(VI) lần lƣợt là 353,6 và 444,8 nm. Phép đo đƣợc lặp lại khi cho thêm As(III) và đo cƣờng độ huỳnh quang sẽ xác định đƣợc nồng độ As(III) theo 2 đƣờng chuẩn:
F = 611 + 816C(μg/ml) ( r = 0,9999 với giới hạn nồng độ từ 5 – 100 ng/ml)
F = 391 + 141C(μg/ml) ( r = 1 với giới hạn nồng độ từ 100 ng/ml – 1 μg/ml)
Để xác định tổng lƣợng As(III) và As(V) có trong mẫu, khử As(V) về As(III) bằng natri metabisulphite, đun nóng 90- 100oC để đuổi lƣợng dƣ chất khử.
Hơn 35 cation, anion và một vài phức đƣợc nghiên cứu và kết luận: với lƣợng dƣ gấp 1000 lần nồng độ As(III) của EDTA, tartrate, sulphate, phosphate, nitrate, clorua, ion kim loại kiềm và kiềm thổ, 500 lần Zn2+
, Cd2+, Ni2+, Co2+, Al3+, 100 lần Mn2+
, Th4+, Cr3+, Os8+, 50 lần Bi3+
, Hg2+ không gây ảnh hƣởng tới phép đo. Khi có mặt của EDTA, lƣợng dƣ Fe3+
, Cu2+ 100 lần không gây ảnh hƣởng. Ảnh hƣởng của Fe2+
đƣợc loại trừ bằng cột trao đổi cation Amberlite IR – 120 và loại Sb3+ bằng kết tủa với antimony pyrogallate. Giới hạn phát hiện là 1,5 ppb. Phƣơng pháp có độ đúng và tin cậy cao đƣợc ứng dụng xác định Asen trong những nền phức tạp, mẫu có nhiều nguyên tố ảnh hƣởng ( hợp kim), mẫu môi trƣờng và sinh học. [33]
1.2.2.4. Phương pháp biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị
Phƣơng pháp dựa trên khả năng đề kháng của vi khuẩn trong môi trƣờng có asen. Biosensor hoạt động tùy thuộc vào nồng độ của asen trong môi trƣờng mà nó tạo ra tín hiệu điện tử tỷ lệ với nồng độ của asen. Phản ứng phát hiện có thể là hoạt động của một enzym hay liên kết của chất phân tích với một kháng thể hay một chất nhận… Các tín hiệu thu đƣợc có thể là tín hiệu quang học hoặc điện hóa tuyến tính với một hay nhiều chất phân tích. Thành
phần quan trọng của vi khuẩn chỉ thị asen là plasmit, trong tế bào vi khuẩn có chứa gen kháng asen tự nhiên và gen chỉ thị, hai đoạn gen này đƣợc nối với nhau cùng hoạt động dƣới sự điều khiển của một promoter. Khi vi khuẩn tiếp xúc với môi trƣờng có chứa asen, asen đƣợc thấm qua màng tế bào vi khuẩn thông qua con đƣờng hấp thụ, vận chuyển tích cực hay thụ động nó sẽ liên kết với protein điều hòa dẫn đến hoạt hóa sự phiên mã của gen chỉ thị. Gen chỉ thị mã hóa tạo ra ezym luciferase xúc tác cho phản ứng phát quang:
n-decanal + FMNH2 + O2 → Axit decanoic + FMN + hv
Phản ứng phát sáng của luciferase vi khuẩn bao gồm sự oxy hóa khử monolucleotit flavin và 1 aldehyt chuỗi dài làm cơ chất để phản ứng với ezym và kết quả là sản sinh ra ánh sáng màu xanh ở bƣớc sóng 490 nm. [32]
Kết luận: Căn cứ vào các tài liệu tham khảo đƣợc, để việc xác định asen đơn giản, có khả năng khả thi trong các phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phƣơng pháp xác định asen bằng phƣơng pháp trắc quang với thuốc thử Safranin.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên tắc của phương pháp trắc quang xác định hàm lượng asen bằng Safranin.
Safranin T (Tolusafranin; 3,6- diamino- 2,7- dimetyl-10 phenyl phenazin clohidrat (I); 3- 6- diamino- 2,7- dimetylphenazin (II)).
N+ N CH3 NH2 H3C H2N Cl- (I) M=350,8 N+ N CH3 NH2 H3C H2N Cl- (II) M=364,9 CH3
Safranin T là hỗn hợp của hai chất I và II
Safranin T là chất bột màu đỏ, rất độc, tan trong nƣớc cho dung dịch màu đỏ [2]. Dung dịch trong rƣợu etylic có màu đỏ, phát huỳnh quang màu đỏ vàng. Trong dung dịch rƣợu etylic hấp thụ cực đại với ánh sáng có λ = 539 và 503,2 nm
Phản ứng:
- Khi thêm HCl đặc vào dung dịch safranin trong nƣớc sẽ đƣợc dung dịch có màu tím xanh.
- Safranin tác dụng với NaOH sẽ tạo kết tủa màu đỏ nâu
- Trong dung dịch H2SO4 đặc cho dung dịch màu xanh lá cây, pha loãng dung dịch bằng nƣớc thì dung dịch sẽ chuyển thành xanh sau đó có màu đỏ.
Safranin là chất chỉ thị oxi hóa khử (có Eo = 0,289 V), khi bị oxi hóa thì nó tạo sản phẩm không màu
Sự làm mất màu của safranin khi có mặt iodate trong môi trƣờng axit xảy ra theo cơ chế nhƣ sau [21]:
+ As(III) phản ứng với KIO3 trong môi trƣờng axit để giải phóng ra I2 theo phản ứng:
2AsO2- + 2IO3- + 2H+ → 2AsO3- +I2 + 4H2O
+ I2 sinh ra sẽ oxi hóa làm mất màu thuốc thử safranin tạo ra sản phẩm không màu: N+ N CH3 NH2 H3C H2N I2,H+ N H N CH3 NH2 H3C H2N
Màu đỏ không màu
Vì vậy, bằng cách theo dõi sự giảm độ hấp thụ quang của Safranin theo nồng độ As(III) thì có thể định lƣợng đƣợc As(III) trong mẫu theo phƣơng pháp thời gian ấn định hoặc phƣơng pháp tg.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu của luận văn gồm:
- Tối ƣu hóa các điều kiện của phép xác định gồm nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố sau đến phản ứng chỉ thị:
+ Phổ hấp thụ của dung dịch chất màu và chọn cực đại hấp thụ để đo độ hấp thụ quang.
+ Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng. Theo dõi biến thiên tốc độ phản ứng để chọn phƣơng pháp tg hay phƣơng pháp thời gian ấn định.
+ Ảnh hƣởng của nồng độ đầu các tác nhân phản ứng nhƣ KIO3, Safranine đến tốc độ phản ứng.
+ Ảnh hƣởng của môi trƣờng phản ứng .
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của các ion lạ đến phép xác định.
- Đánh giá phƣơng pháp phân tích : gồm khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng, khoảng tuyến tính; đánh giá độ chụm và độ chính xác của phƣơng pháp phân tích, tính hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phân tích.
- Xây dựng qui trình phân tích và ứng dụng phân tích mẫu thực tế.
2.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị
* Bình định mức thủy tinh loại A có dung tích 25, 50, 100, 250, 500 ml. * Cốc thuỷ tinh chịu nhiệt dung tích 100, 250 ml.
* Bình nón dung tích 250 ml, buret 25 ml.
* Các loại pipet chia vạch: 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 25 ml.
* Máy trắc quang UV - VIS 1601 PC - Shimadzu (Nhật Bản), bƣớc sóng làm việc tử 190- 900 nm , cuvet thủy tinh chiều dày l = 1cm.
* Cân phân tích Scientech SA 210 độ chính xác 0,0001g. * Máy điều nhiệt.
* Đồng hồ bấm giờ. * Máy đo pH.
2.2.2. Hóa chất
Các hóa chất cần dùng là loại tinh khiết phân tích (p.a. và tinh khiết thuốc thử (p.R.). Các dung dịch đƣợc pha chế bằng nƣớc cất hai lần.
Pha các dung dịch tiêu chuẩn:
+ Pha 100,00 ml As(III) 1000ppm từ từ As2O3 tinh thể
Cân chính xác 0,1320 gam As2O3 tinh thể trên cân phân tích, hòa tan lƣợng cân này bằng dung dịch NaOH loãng, sau đó đun nóng dung dịch cho As2O3 tan
hết, chuyển vào bình định mức 100,00 ml, tráng rửa cốc cân vài lần bằng nƣớc cất hai lần rồi chuyển vào bình định mức trên, thêm nƣớc cất tới vạch mức, sóc trộn đều dung dịch ta đƣợc 100,00 ml dung dịch As(III) 1000ppm.
+ Thiết lập lại nồng độ As(III) bằng dung dịch Iot tiêu chuẩn
- Pha 100,00 ml dung dịch I2 0,0127 M từ Iot tinh thể
Cân 0,32g Iot trên cân kỹ thuật. Hòa tan sơ bộ lƣợng cân này bằng nƣớc cất, sau khi iot tan hết thêm khoảng 10g KI. Thêm nƣớc cất tới vạch mức, sóc trộn đều dung dịch đƣợc dung dịch I2 có nồng độ sấp sỉ 0,0127 M. Dung dịch vừa pha bảo quản trong chai thủy tinh màu nút nhám.
- Pha 100,00 ml dung dịch Na2S2O3 0,025M từ Na2S2O3 tinh thể
Cân 0,62g Natri thiosunfat trên cân kỹ thuật, hòa tan sơ bộ bằng nƣớc cất, chuyển vào bình dịnh mức 100,00 ml, tráng rửa cốc cân, thêm nƣớc cất