Sơ đồ nghiên cứu nhân giống nuôi cấy mô tế bào cây Ba Kích tím
Chọn mâu cấy
Khử trùng mẫu cấy
Cấy khở đầu
Nhân nhanh chồi
Tạo cây hoàn chỉnh
Huấn luyện cây mô
* Cấy khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy invitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt, khử trùng mẫu bằng chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn.
Phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy: Chồi Ba kích tím cắt bảo quản trong vải ẩm, đƣợc đem rửa sạch bằng bột giặt dƣới vòi nƣớc 3 lần.Mẫu đƣợc cắt một phần cuống lá và toàn bộ phiến lá. Rửa sạch bằng nƣớc máy và tráng 3 lần bằng nƣớc cất. Đem ngâm trong nƣớc cất 20 phút, tráng lại 3 lần bằng nƣớc cất đã khử vô trùng. Sau đó khử trùng bằng hóa chất khử trùng. Kết thúc khử mẫu đƣợc cắt bỏ phần ngọn non, một phần cuống lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 – 3cm, đƣờng kính từ 2-3mm, mang 2-4 nách lá.
- Hóa chất khử trùng: Clolox, oxy già (H2O2), thủy ngân chlorua (HgCl2).
- Môi truờng nuôi cấy: MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 30g saccarose/ lít, 5g Aga / lít, pH= 5,8 - 6
Thí nghiệm 1: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng bằng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Các công thức nhƣ sau:
CTTN Thời gian và nồng độ sử lý nƣớc Clolox
CT 1 ĐC
CT2 5% + 10 phút CT 3 5% + 20 phút CT4 5% + 30 phút
Thí nghiệm 2: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng bằng H2O2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Các công thức nhƣ sau:
CTTN Thời gian và nồng độ xử lý nƣớc oxy già
ĐC ĐC
CT2 5% + 10 phút CT3 5% + 20 phút CT4 5% + 30 phút
Thí nghiệm 3: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng bằng thủy ngân clorua (HgCl2) tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Các công thức thí nghiệm nhƣ sau:
CTTN Thời gian và nồng độ xử lý nƣớc HgCl2
ĐC ĐC
CT2 0,1% HgCl2 trong 5 phút CT3 0,1% HgCl2 trong 10 phút CT4 0,1% HgCl2 trong 15 phút
* Giai đoạn nhân nhanh chồi
- Các chồi sinh trƣởng bình thƣờng có đầy đủ thân và lá (không bị dị dạng) đƣợc sử dụng làm vật liệu cấy chuyển sang môi trƣờng nhân nhanh. Trong giai đoạn này tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng là BAP, Kinetin đến sự nhân nhanh của chồi cây Ba kích.
- Môi trƣờng nền (MT nền) đƣợc sử dụng là MS bổ sung 30g saccarose/ lít, 6g Agar/ lít , pH = 5,8.
Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐTST BAP đến hệ số nhân chồi
CTTN Thành phần môi trƣờng
ĐC ĐC
CT2 MS + 1mg/l BAP CT3 MS + 2mg/ BAP CT4 MS + 3mg/l BAP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm 5: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐTST Kinetin đến hiệu quả nhân
chồi CTTN Thành phần môi trƣờng ĐC ĐC CT 2 MS + 1mg/l Kinetin CT 3 MS + 2 mg/l Kinetin CT 4 MS + 3 mg/l Kinetin
Thí nghiệm 6: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐTST BAP + Kinetin đến hệ số
nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu.
CTTN Thành phần môi trƣờng
ĐC ĐC
CT 2 MS + mg/l BAP + mg/l Kinetin CT 3 MS + mg/l BAP + mg/l Kinetin CT 4 MS + mg/l BAP + mg/l Kinetin
* Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
- Mẫu nuôi cấy: chồi Ba kích khỏe mạnh có từ 4- 6 lá thu đƣợc từ quá trình nhân nhanh.
- Thí nghiệm 7: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐTST NAA đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích.
CTTN Nồng độ và chất điều hòa sinh trƣởng
ĐC ĐC
CT 2 1/2MS + 1mg/l NAA
CT 3 1/2MS + 2mg/l NAA
CT 4 1/2MS + 3mg/l NAA
Thí nghiệm 8: nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐTST IBA đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích.
CTTN Nồng độ và chất điều hòa sinh trƣởng
ĐC ĐC
CT 2 1/2MS + 1mg/l IBA
CT 3 1/2MS + 2mg/l IBA
CT 4 1/2MS + 3mg/l IBA
* Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao cây con ở giai đoạn vườn ươm.
Trƣớc khi đƣa cây con trong ống nghiệm ra cấy ngoài vƣờn ƣơm, đề tài chuyển các bình cây (cây hoàn chỉnh trong bình) ra môi trƣờng bên ngoài, mục đích để cây làm quen dần với điều kiện ngoài vƣờn ƣơm (gọi là giai đoạn huấn luyện). Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cƣờng độ ánh sáng từ 5000 - 10000 lux, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây.
Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút ngắn hoặc kéo dài so với sản xuất. Đề tài thử nghiệm 4 khoảng thời gian huấn luyện cây con.
+ Không huấn luyện (0 ngày) + 5 ngày
+10 ngày + 15 ngày
Sau khi huấn luyện, cây con đƣợc cấy ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến hành đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trƣởng của cây để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng chiều cao của cây trong giai đoạn vƣờn ƣơm.
- Tạo bầu cấy cây: dùng bầu nhựa PE có đƣờng kính 5,5cm, cao 11cm, có đục lỗ dƣới đáy. Thành phần ruột bầu là đất tầng B + Trấu hun
- Xử lý bầu: trƣớc khi cấy 1-2 ngày, bầu đất đƣợc xử lý khử trùng nấm bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hòa thuốc tím vào nƣớc và dùng ô doa tƣới nên bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm).
- Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt từng cây ra khỏi môi trƣờng nuôi cấy và rửa sạch. Tiếp đó ngâm cây vào nƣớc để tránh hiện tƣợng mất nƣớc, rồi đem trồng vào giá thể. Chăm sóc cây sau khi cấy, cây sau khi cấy đƣợc che bằng nilon trắng 15 – 20 ngày sau khi cấy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Điều kiện thí nghiệm
Quá trình nuôi cấy (nuôi cấy khởi đầu, nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh) đƣợc tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm duy trì nhƣ sau:
+ Ánh sáng: mẫu đƣợc nuôi cấy dƣới ánh đèn neon với cƣờng độ ánh sáng từ 2000- 25000 lux, thời gian chiếu sáng 8 - 10h/ ngày.
+ Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì 25 20c + Độ ẩm thƣờng xuyên xấp xỉ 60 – 70%