CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus
3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Các dòng thuốc lá chuyển gen sau 2-3 tuần phát triển khoẻ mạnh trong nhà lưới đạt có 5-6 lá thật với kích thước lá khoảng 10cm được thử nghiệm khả năng kháng virus TMV theo phương pháp lây nhiễm nhân tạo (Herber et al., 1996)[20]. Kết quả sau lần lây nhiễm đầu tiên đã thu được 20 cây không nhiễm bệnh.
Với các mẫu thuốc lá không nhiễm bệnh này chúng tôi tiến hành thu maauc và chuẩn bị tách ADN tổng số sử dụng làm khn cho phản ứng PCR.
Hình 2.4. Cây thu được sau lây nhiễm
a. Cây không bị nhiễm bệnh b. Cây biểu hiện bệnh sau lây nhiễm
3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây
ADN tổng số từ những mẫu thuốc lá này được tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển trong các mẫu thuốc lá. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 %.
3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số
Để thực hiện phản ứng PCR trước tiên phải tiến hành tách ADN tổng số có chất lượng tốt. Bước đầu tiên trong quá trình tách chiết ADN là nghiền mẫu trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn bổ sung dung dịch đệm, dung dịch này có tác dụng tách pha tốt trong q trình ly tâm.
Hình 3.3. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,8%
Kết quả điện di cho thấy các băng đều và rõ nét, chúng tôi kết luận đã tách chiết thành công ADN tổng số phục vụ cho phản ứng PCR.
3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR
Các cây không nhiễm bệnh được thu mẫu để khẳng định sự có mặt của cấu trúc chuyển gen bằng phương pháp PCR.
Kết quả phân tích cho thấy, có 18 cây/ 20 cây cho kết quả dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV/Fi- TMV-Ri (hình 3.4). Đối chứng dương là plasmid TMV-RNAi làm khuôn mẫu. Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu là ADN tổng số tách chiết từ lá thuốc lá không chuyển gen (2 mẫu) đều cho kết quả âm tính. Điều này đảm bảo đoạn gen chuyển khơng có sẵn trong cây khơng chuyển gen. Như vậy, kết quả dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/TMV-Ri của 20 cây thuốc lá đã chuyển gen chứng tỏ đây là những cây thuốc lá có mang cấu trúc gen cần chuyển.
Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong 20 mẫu thuốc lá C9-1.
M: Thang ADN chuẩn 1 kb, (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn là ADN tách từ cây thuốc lá không chuyển gen; 1- 20: 20 cây thuốc lá chuyển gen; (+) Đối chứng dương là plasmid TMV-RNAi