CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây
3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 đã được Vân và cộng sự [12] [13] thiết lập. Theo quy trình này, các lá bánh tẻ được cắt thành những mảnh có kích thước 1cm2 và đặt lên môi trường tái sinh GM (MS cơ bản,1mg/l BAP, 30g/l glucose,8g/l agar, pH5,8) 2 ngày trước khi biến nạp sau đó được ni cộng sinh với dung dịch huyền phù của Agrobacterium trong 2 ngày và chuyển sang mơi trường GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc cũng như kháng sinh diệt khuẩn. Giống thuốc lá C9-1 có lá nhỏ và mảnh hơn giống K326, lặp lại việc đặt các mảnh lá trên môi trường GM trước biến nạp cho hiệu quả tái sinh cây thấp. Do vậy, đối với giống C9-1, các mảnh lá hình vng kích thước khoảng 0,5 cm2 được cắt ra từ cây in vitro và ngâm vào dung dịch huyền phù
Agrobacterium (OD600=0.7-1) có lắc nhẹ trong 30 phút. Việc giảm kích thước
các mảnh lá xuống một nửa đồng thời lắc nhẹ trong dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thương thực vật và dịch khuẩn, là một trong những biện pháp có thể làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen.
Sau 30 phút, thấm khô và đặt các mảnh lá vào bình chứa mơi trường GM và chuyển sang mơi trường GM mới. Do vector pCB-GUS có mang đoạn gen kháng kanamycine, nên các môi trường sau biến nạp đều được bổ sung 50mg/l kanamycine để chọn lọc các cụm chồi chuyển gen. Trong nghiên cứu này, những kết quả về cụm chồi/cây đề cập đến là những cụm chồi/cây sống sót trên mơi trường chọn lọc có chứa kanamycine. Cefotacime (400mg/l) cũng được bổ sung vào môi trường nhằm loại bỏ vi khuẩn cịn sót lại trên các mảnh lá.
Thí nghiệm chuyển gen gus vào cây thuốc lá C9-1 được lặp lại 2 lần, mỗi lần với 30 mảnh lá nguyên liệu. Sau 10 ngày tại những vết cắt ở các mảnh lá xuất hiện những cụm tế bào cứng, có màu xanh lá ( hình 3.1)
Theo nghiên cứu trước về quá trình tái sinh cây thuốc lá, đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi [8][7]. Kinetin là chất điều khiển sinh trưởng thuộc nhóm cytokine, có tác dụng kích thích tạo và phát triển chồi. Vai trị của kinetin
trong tạo chồi đã được chứng minh trên nhiều đối tượng thực vật, ở cả cây một lá mầm và hai lá mầm. Với 30mảnh lá /lần biến nạp (lặp lại thí nghiệm 2 lần) thu được trung bình 24,5± 2,12 mảnh lá có cảm ứng, đạt tỷ lệ khoảng 81,6± 7,07 (bảng 3.1). Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng được thiết lập bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá C9-1trực tiếp lên mơi trường GM và GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc. Toàn bộ mảnh lá không chuyển gen được đặt lên mơi trường có bổ sung kháng sinh đều vàng dần và chết. Trong số 2x4 mảnh lá đặt lên môi trường cảm ứng khơng bổ sung kháng sinh có trung bình 3,5 ± 0,7 mảnh lá tạo mơ sẹo, đạt tỷ lệ khoảng 87,5± 17,6
Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá
Lơ thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm
Số mẫu cảm ứng Tỷ lệ (%)
pCB-GUS 2x30 24,5± 2,12 81,6± 7,07
WT1 2x4 0 0
WT2 2x4 3,5 ± 0,7 87,5± 17,6
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá khơng chuyển gen đặt lên mơi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh
Sau khoảng 2 tuần, bắt đầu quan sát được những chồi nhỏ. Tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trường MS cơ bản, không bổ sung chất điều khiển sinh trưởng. Sau 3 tuần, 100% mảnh lá lô không chuyển gen đều thu được chồi, với tỉ lệ trung bình là 3,4± 0,25 chồi/mảnh lá. Số lượng mẫu tạo chồi trung bình ở lơ chuyển gen là 3,2± 0,25 với số chồi trung bình 3,2± 0,25 chồi/mảnh lá (bảng 3.2). Như vậy, khơng có sự khác biệt đánh kể trên các lô cây chuyển gen và không chuyển gen, chứng tỏ quá trình tái sinh cây thuốc lá thiết lập trong thí nghiệm này có hiệu quả. Trong qui trình tái sinh cây thuốc K326, các mảnh lá sau khi cảm ứng chồi vẫn được tiếp tục phát triển trên môi trường
có bổ sung kinetin 1mg/l. Qui trình tái sinh giống C9-1 ban đầu cũng được lặp lại tương tự như giống K326. Trong q trình thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy ở lô đối chứng không bổ sung kinetin, hiệu quả tạo chồi cao hơn đáng kế. Do vậy, chúng tơi lựa chọn mơi trường khơng có chất điều khiển sinh trưởng làm môi trường tối ưu cho phát triển cụm chồi đối với giống C9-1. Điều này có thể giải thích do sự khác biệt về kiểu gen giữa 2 giống thuốc lá, chỉ cần bổ sung một lượng nhỏ kinetin (1mg/l) trong thời gian ngắn (2-3 tuần) là thích hợp để kích thích cảm ứng chồi của mơ lá thuốc lá C9-1.
Bảng 3.2: Kết quả tạo chồi
Lơ thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Tỷ lệ (%) Tổng số chồi Số chồi trung bình pCB-GUS 24,5± 2,12 19,5± 0,7 79,75± 4,03 63± 7,07 3,2± 0,25 WT1 0 0 0 0 0 WT2 3,5 ± 0,7 3,5± 0,7 100 12± 1,4 3,4± 0,25
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên mơi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh
3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh
Tạo rễ là khâu cuối cùng trong nuôi cấy in vitro và có ý nghĩa quan trọng đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. Những nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen trên cây thuốc lá ghi nhận IBA, NAA và IAA là những hormone sinh trưởng được lựa chọn trong nghiên cứu tạo rễ. Nồng độ các chất điều khiển sinh trưởng dao động trong khoảng 0,1 mg/l. Vẫn tiếp tục lặp lại qui trình tái
sinh thuốc lá đã công bố của Vân và cs, môi trường MS bổ sung 0,1mg/l NAA được thử nghiệm tạo rễ thuốc lá C9-1 in vitro. Cụm chồi 4 tuần tuổi có chiều cao 1cm được tách nhỏ và chuyển sang môi trường tạo rễ. Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết các chồi, tỷ lệ gần 90% (bảng 3.3). Các chồi đều phát triển xanh tốt và tạo nhiều lá mới. Quan sát thấy các chồi không chuyển gen trên mơi trường đối chứng cũng có q trình tạo rễ tương tự.
Bảng 3.3. Tỷ lệ chồi ra rễ trên mơi trường RM
Lơ thí nghiệm Số chồi cấy trên môi trường ra rễ
Số chồi ra rễ Tỷ lệ (%)
pCB-GUS 63± 7,07 55± 8,4 87.1± 1,9
WT1 0 0 0
WT2 12± 1,4 10,5± 0,7 87,7± 4,4
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá khơng chuyển gen đặt lên mơi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh
Khi các cây in vitro đạt chiều cao từ 5- 7 cm tiến hành đưa ra ngoài bầu đất. Giá thể thích hợp là 50% trấu, 50% cát. Hai loại giá thể này có độ xốp tốt tuy nhiên khả năng giữ nước kém vì vậy phải chú ý việc chăm sóc tưới nước cho cây. Chăm sóc khoảng 2 tuần trong điều kiện phịng thí nghiệm.
Khi cây non có bộ rễ hồn chỉnh được chuyển từ giá thể cát, trấu sang trồng trên giá thể với thành phần chủ yếu là đất đất phù sa trong điều kiện nhà lưới. Từ những kết quả trên, chúng tơi đề ra quy trình chuyển gen và tái sinh cây thuốc lá (giống C9-1) như sau:
- Mảnh lá bánh tẻ kích thước 0,5cm2 được ngâm trong dịch huyền phù
Agrobacterium (OD600=0.7-1) trong 30 phút và đồng nuôi cấy trên môi trường
cảm ứng chồi (MS+1mg/lBAP) trong 3 ngày
- Sau 2-3 tuần trên môi trường cảm ứng, chuyển sang môi trường tạo cụm chồi (MS)
- Sau 3-4 tuần, tách các chồi đơn và chuyển sang môi trường ra rễ (MS+0,1mg/l NAA)
- Cây rễ hoàn chỉnh 4-5 tuần tuổi đủ điều kiện để chuyển sang trồng trong bầu trấu-cát (tỷ lệ 1: 1)
A B C
G
H I
Hình 3.1. Kết quả chuyển gen gus vào cây thuốc lá A: Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn
B: Mảnh lá được đặt trên môi trường cảm ứng C: Mảnh lá bắt đầu cảm ứng sau 10 ngày quan sát
D: Các mảnh lá không biến nạp đặt trên môi truong bổ sung kháng sinh vàng dần và chết
E: Cụm chồi xuất hiện trên môi trường chọn lọc F: Tách chồi chuyển sang môi trường ra rễ
G: Cây trồng trong môi trường ra rễ sẵn sàng cho ra bầu H: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trong bầu cát: trấu I: Cây trồng trong điều kiện nhà lưới sau 2 tuần