3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật
Cây thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 0.6- 2 m hoặc hơn, phần thân trên mặt đất, lụi hàng năm. Rễ củ gồm củ mẹ ở giữa và các củ con mọc xung quanh, có hình con quay, hình nón thuôn, đường kính 1-4 cm, dài 3-9 cm. Thân khí sinh mọc thẳng ít phân cành, phần thân non và ngọn có lông đơn bào cong. Lá đơn, mọc so le, phiến lá có dạng gần hình tim tròn hoặc xẻ 3 thùy sâu, hai thùy bên xẻ tiếp thành 5 thùy không đều nhau, mép khía răng cưa to, gân lá 5 hình chân vịt, cuống lá, mặt trên có lông tơ. Cụm hoa dạng chùm đơn, mọc ở ngọn thân và kẽ lá, dài 10-30 cm gồm nhiều hoa màu xanh tím. Cuống hoa dài 2-6 cm, cuống hoa và cụm hoa có lông tơ dày cong, các lá bắc ở phần dưới cụm hoa chia 3 thùy hình mác, 2 lá bắc con nhỏ dài 4- 8mm, rộng 1-2.5 mm, 2 mặt có lông tơ. Hoa không đều lưỡng tính, 5 lá đài mặt ngoài có lông tơ ngắn, lá đài trên hình mũ cao, hơi dẹt trùm lên 2 lá đài bên và 2 cánh hoa dài 2-3cm, rộng 1.8-2.5 cm. Hai lá đài bên hình trứng dài 1.7-2.2 cm, rộng 1.8-2.6 cm. Hai lá đài dưới thuôn dài 1.3-2 cm, rộng không đều nhau. Tràng hoa gồm 2 cánh hoa tiêu giảm, nhẵn, dài 1.8-2.1 cm nằm trong lá đài trên, hai bên cuộn vào thành hình trụ. Nhị nhiều (40-46) không có lông, dài 9-12 mm, chỉ nhị rộng có cánh ở dưới, bao phấn 2 ô đính gốc hình cầu hoặc elip nứt dọc. Bầu trên dài 5-12 mm, có lông nhỏ rải rác. Lá noãn 5, rời, mỗi lá noãn có nhiều noãn, đính bên. Vòi nhụy ngắn hơn bầu nhụy. Quả gồm 5 đại hình elip dài 1.5-2.5 cm, đường kính 0.5 cm, có mỏ ngắn, đài không tồn tại. trong mỗi đại chứa 10-20 hạt dẹt, dài 4-5mm, rộng 2-3 mm, có cánh mỏng.
Đặc điểm hình thái thực vật của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang được trình bày ở các hình từ 3.1 đến 3.10.
44
Hình 3.1. Tiêu bản cây Ô đầu Hình 3.2. Cành mang hoa, quả
Hình 3.3. Lá mặt trên Hình 3.4. Lá mặt dưới
45
Hình 3.5. Hoa Hình 3.6. Các bộ phận của hoa
Hình 3.7. Nhụy hoa Hình 3.8. Nhị hoa
Hình 3.9. Quả và hạt Hình 3.10. Củ
46
3.1.2. Xác định tên khoa học
Căn cứ vào kết quả phân tích đặc điểm hình thái và khóa phân loại Thực vật chí Trung Quốc (2001), cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang đã được xác định tên khoa học
là: Aconitum carmichaeli Debeaux. họ Ranunculaceae (Mẫu giám định chi tiết tên
khoa học được trình bày trong phụ lục 2)
Mặt khác mẫu lá tươi được chiết xuất, phân tách, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen đã công bố của các loài Aconitum cho kết quả như sau:
* Tách chiết ADN tổng số và thực hiện phản ứng nhân gen PCR:
ADN tổng số sau khi tách được điện di trên gel agarose 1 % cho vạch ADN rõ, băng điện di sạch, không lẫn ARN. ADN tổng số sau khi thực hiện phản ứng nhân gen với đoạn ITS1-5,8S-ITS2 được điện di so sánh với thang ladder chuẩn 100 bps, cho thấy kích thước đoạn trình tự thu được vào khoảng hơn 600 bps. Vạch sản phẩm trên băng điện di đậm, rõ nét nên đủ điều kiện để tiếp tục tinh sạch để thực hiện phản ứng giải trình tự.
Hình 3.11. Điện di ADN tổng số Hình 3.12. Điện di sản phẩm PCR
* Trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2:
Trình tự ADN sau khi giải trình tự thu được gồm 640 bps trong đó có 609 bps hiện rõ, được đưa vào để so sánh với trình tự công bố, trong đó tỷ lệ G-C là 62.3 %, tỷ lệ A-T là 37.7 %. Công cụ NCBI/Blast được sử dụng để so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (mã hiệu genbank: FJ424223) cho thấy trình tự gen thu
47
được tương đồng với trình tự loài A. carmichaeli Debx. đã công bố với số nucleotid tương đồng là 606/609 (tương ứng tỷ lệ tương đồng 99%).
Hình 3.13. So sánh trình tự đoạn gen ITS1-5,8S- ITS2 của mẫu nghiên cứu với trình tự loài đã công bố trên thế giới.
Trong đó: Query là trình tự mẫu nghiên cứu và Sbjct là trình tự loài A. carmichaeli
Debx. đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (mã hiệu genbank: FJ424223) [83], [146].
Kết quả giải trình tự gen (chi tiết xem tại Phụ lục 1) và so sánh trình tự gen của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang với trình tự gen loài là A. carmichaeli Debx. là cơ sở tin cậy để khẳng định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: Aconitum
48
3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong cây Ô đầu 3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong cây Ô đầu
3.2.1.1.Định tính các nhóm chất hữu cơ
Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Ô đầu
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Đánh giá Củ Thân Lá Hoa Hạt (1) (2) (3) (4) (5) (5) (7) (8) (9) 1 Alcaloid TT Mayer +++ ++ +++ +++ ++ Có TT Dragendorff +++ ++ +++ +++ ++ TT Bouchardat +++ ++ +++ +++ ++
2 Polysaccharid TT Lugol +++ - + - - có trong củ 3 Flavonoid Cyanidin - - ++ ++ - Có trong lá, hoa Kiềm - - +++ ++ ++ FeCl3 5% + + +++ +++ ++
4 Chất béo Để vết mờ trên gấy lọc +++ - - - ++ Có trong hạt, củ
5 Tinh dầu Có mùi thơm - - - Không có
6 Carotenoid H2SO4 đặc - ++ + + ++ Có trong thân, lá, hoa, hạt 7 Sterol Liebermann – Bourchardat ++ - ++ + - Có trong củ, lá, hoa 8 Coumarin Mở và đóng vòng lacton + - + + - Không có Diazo + - + + - Quan sát huỳnh quang - - - - -
49
10 Acid hữu cơ Na2CO3 khan ++ + ++ + + Có
11 Glycosid tim
TT Xanthydrol - - - - -
Không có
TT Legal - - - - -
12 Antranoid P/ư Bortraeger - - - Không có 13 Saponin Hiện tượng tạo
bọt - - - - - Không có
14 Đường tự do TT Fehling ++ + + + + Có
15 Acid amin TT Ninhydrin + + + + + Có
Ghi chú: - : Phản ứng âm tính
+ : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ +++: Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy thành phần chính là alcaloid có trong củ, thân, hoa, lá, hạt; flavonoid có chủ yếu trong lá; polysaccharid có chủ yếu trong củ. Ngoài 3 thành phần hóa học chính này, cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang còn có acid béo, acid amin, đường tự do, sterol, carotenoid.
3.2.1.2. Định lượng một số nhóm chất hữu cơ
Định lƣợng alcaloid:
Hàm lượng alcaloid toàn phần và aconitin trong mẫu dược liệu, phân đoạn dịch chiết từ Phụ tử được trình bày ở bảng 3.2. (phương pháp định lượng trình bày ở phụ lục 3).
Bảng 3.2. Hàm lượng alcaloid trong Ô đầu, Phụ tử trồng ở Hà Giang
TT Mẫu định lƣợng Hàm lƣợng alcaloid tp (% kl/kl) Hàm lƣợng aconitin (% kl/kl) 1 Ô đầu sống (củ mẹ) 0.70 ± 0.04 0.125 ± 0.002 2 Phụ tử sống (củ con) 0.93 ± 0.06 0.072 ± 0.003 3 Phân đoạn D chiết từ Phụ tử 28.61 ± 0.75 0.066 ± 0.002 4 Phân đoạn E chiết từ Phụ tử 26.83 ± 0.68 0.015± 0.003
50
Nhận xét: Qua kết bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử cao hơn Ô đầu nhưng hàm lượng aconitin trong Phụ tử thấp hơn Ô đầu. Hàm lượng alcaloid toàn phần và aconitin trong PĐ D cao hơn PĐ E.
Định lƣợng flavonoid:
Hàm lượng flavonoid trong lá và phân đoạn chiết từ lá cây Ô đầu, xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis được trình bày ở bảng 3.3. (Phương pháp được xây dựng và thẩm định trình bày ở phụ lục 4).
Bảng 3.3. Hàm lượng flavonoid trong lá cây Ô đầu trồng ở Hà Giang
TT Mẫu định lƣợng Hàm lƣợng flavonoid (% kl/kl)
1 Lá cây Ô đầu 1.60 ± 0.02
2 Phân đoạn C chiết từ lá 38.24 ± 0.92 3 Phân đoạn E chiết từ lá 30.42 ± 0.79
Ghi chú: PĐ C, PĐ E được chiết xuất theo quy trình ở hình 3.17 mục 3.2.2
Nhận xét: Qua kết bảng 3.3 cho thấy, hàm lượng flavonoid toàn phần (tính theo quercetin) trong lá cây Ô đầu khá cao (1.6 %), trong PĐ C cao hơn PĐ E.
Định lƣợng polysaccahrid:
Hàm lượng polysaccharid trong Ô đầu, Phụ tử và phân đoạn chiết từ Phụ tử, xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis được trình bày ở bảng 3.4. (Phương pháp được xây dựng và thẩm định như Phụ lục 5).
Bảng 3.4. Hàm lượng polysaccharid trong Ô đầu, Phụ tử trổng ở Hà Giang
TT Mẫu định lƣợng Hàm lƣợng polysaccharid (% kl/kl)
1 Ô đầu sống (củ mẹ) 14.52 ± 0.48
2 Phụ tử sống (củ con) 19.63 ± 0.74
3 Phân đoạn I chiết từ Phụ tử 87.6 ± 0.84 4 Phân đoạn II chiết từ Phụ tử 72.8 ± 0.83
Ghi chú: PĐ I, PĐ II được chiết xuất theo quy trình ở hình 3.16 mục 3.2.2
Nhận xét: Qua kết bảng 3.4 cho thấy hàm lượng polysaccharid toàn phần (tính theo D-Glucose) trong Phụ tử cao hơn Ô đầu, trong PĐ I cao hơn PĐ II.
51
3.2.1.3. Định lượng các kim loại nặng
Hàm lượng các kim loại nặng so với dược liệu khô tuyệt đối, xác định bằng phương pháp khối phổ plasma cảm ứng, được trình bày ở bảng 3.5 và phụ lục 6.
Bảng 3.5. Hàm lượng các kim loại nặng trong Ô đầu, Phụ tử
STT Tên kim loại
nặng Hàm lƣợng kim loại nặng trong Ô đầu (mg/kg) Hàm lƣợng kim loại nặng trong Phụ tử (mg/kg) 1 Pb 0.359 0.980 2 Cr 6.939 10.063 3 Mn 22.370 67.208 4 Fe 8.423 31.736 5 Co 0.649 1.479 6 Ni 4.039 2.526 7 Cu 1.457 8.720 8 Zn 13.966 14.956 9 Cd 0.037 0.026 10 Hg 0.062 0.032 11 Ag 0.268 0.164 12 As 0.340 0.913
Nhận xét: Bằng kỹ thuật, thiết bị hiện đại đã xác định được hàm lượng của 12 kim loại nặng trong Ô đầu, Phụ tử sống. Đặc biệt hàm lượng của các kim loại nặng: As, Pb, Hg, Cd đều nằm trong giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn về kim loại nặng có trong thuốc, thực phẩm [7], [8].
3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Ô đầu, Phụ tử
3.2.2.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Phụ tử [109]
Bột Phụ tử (2.8 kg) đã xay thô, sấy khô ở nhiệt độ 60 0C, ngâm chiết bằng ethanol (6 l x 3 lần x 24h/lần). Dịch chiết tổng được loại cặn bằng cách lọc qua giấy lọc, sau đó đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao ethanol (300.8 g). Cao ethanol được phân tán vào ít nước, kiềm hóa bằng amoniac đặc đến pH 9.0, lắc với n-hexan (3 lần x 750 ml/lần), gộp dịch chiết phân đoạn n-hexan và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao n-hexan (130.6 g). Cao n-hexan được phân tách bằng phương pháp sắc ký trên cột silica gel pha thường cỡ hạt 0.063-0.200 mm,
52
với hệ dung môi rửa giải là n-hexan - EtOAc có độ phân cực tăng dần (100:0, 80:20, 50:50, 35:65, 25:75, 15:85) thu được 6 phân đoạn lớn có kí hiệu từ A đến F.
- Phân đoạn A (3.2 g) tiến hành triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - aceton (90:10) thu được chất OD1 (29 mg) tinh thể màu trắng, Rf = 0.33 (n-hexan - aceton, 85:15).
- Phân đoạn B (2.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (85:15) thu được chất OD2 (21 mg), OD3 (19 mg). Trong đó OD2 là tinh thể trắng đục, Rf = 0.30 (n-hexan - EtOAc, 85:15), OD3 là tinh thể màu trắng ngà, Rf = 0,40 (n-hexan - EtOAc, 85:15).
- Phân đoạn C (1.6 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (85:15) thu được chất OD5 (16 mg), chất này hiện màu với thuốc thử Dragendorff, Rf = 0.4 (CH2Cl2 - MeOH = 85:15).
- Phân đoạn D (3.8 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (80:20) thu được chất OP7 (17 mg), chất này hiện màu với thuốc thử Dragendorff, Rf = 0.20 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5). Cũng từ phân đoạn D triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu được chất OD8 (16 mg), Rf = 0.52 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5).
- Phân đoạn E (4.2 g) triển khai sắc ký cột trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu được chất OD9 (16 mg), Rf = 0.45 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5).
- Phân đoạn F (1.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3 - MeOH (90:10) thu được chất OD10 (15 mg), Rf = 0.35 (CHCl3 - MeOH = 95:5).
53
Hình 3.14. Sơ đồ chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Phụ tử
3.2.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Ô đầu [124]
Bột Ô đầu (củ mẹ) (3.2 kg) đã xay thô, sấy khô ở nhiệt độ 60 0C, được ngâm chiết bằng ethanol (6 l x 3 lần x 24 h/lần). Dịch chiết tổng được loại cặn bằng cách lọc
Phụ tử sấy khô (2.8 kg), xay thô (5-10 mm)
Ngâm chiết trong EtOH 96 % (6 l x 3 lần x 24 h/lần)
Dịch chiết ethanol
Cao ethanol (300.8 g)
Cao n-hexan (130.6 g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Chiết bằng n-hexan (3 lần x 750 ml/lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0.063-0.2 mm. Hệ dung môi: n-hexan và EtOAc (tỷ lệ EtOAc tăng từ 0-85 %)
PĐ A (3.2 g) PĐ E (4.2 g) PĐ C (1.6 g) PĐ B (2.1 g) PĐ D (3.8 g) PĐ F (1.1 g) OD1 29 mg SK cột silica gel OD5 16 mg OD2 21 mg OP7 17 mg OD3 19 mg OD8 16 mg OD9 20 mg OD10 15 mg SK cột silica gel
54
qua giấy lọc, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao ethanol (298.9 g). Cao ethanol được phân tán trong ít nước, kiềm hóa bằng amoniac đặc đến pH 9.0, lắc phân đoạn với n-hexan (3 lần x 750 ml/lần), gộp dịch chiết phân đoạn n-hexan và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao n-hexan (129.5 g). Cao chiết n- hexan được phân tách bằng sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.063-0.200 mm, với hệ dung môi rửa giải là n-hexan - EtOAc có độ phân cực tăng dần (100:0, 80:20, 50:50, 35:65, 25:75, 15:85) thu được 6 phân đoạn lớn, kí hiệu từ G đến L. - Phân đoạn G (2.9 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - aceton (90:10) thu được 2 phân đoạn nhỏ OG và OH.
- Phân đoạn H (1.7 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.063- 0.200 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (85:15), thu được PĐ OK. - Phân đoạn I (2.5 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc(80:20) thu được chất OD4 (16 mg), Rf = 0.40 (CHCl3 - EtOAc, 85:15). Cũng từ phân đoạn I triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu được chất OD6 (18 mg), tinh thể có màu trắng đục, Rf = 0.50 (CH2Cl2 - MeOH, 90:10).
- Phân đoạn K (1.5 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (80:20) thu được chất OD7 (12 mg), chất này hiện màu với thuốc thử Dragendorff, Rf = 0.20 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5).
- Phân đoạn L (4.0 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu phân đoạn OL. - Phân đoạn M (2.3 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (90:10) thu được phân đoạn nhỏ