Như vậy phân đoạn chứa alcaloid chiết từ Phụ tử (PĐ E) được thử tác dụng giảm đau bằng 3 mô hình mâm nóng, máy tail-flick và gây quặn đau bằng acid acetic, liều dùng 12.5 mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày, uống trong 3 ngày liên tục có tác dụng giảm đau rõ rệt.
3.3.2.2. Tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn chứa polysaccharid chiết từ Phụ tử Phụ tử
Sau khi chiết xuất và thử độc tính cấp của PĐ I cho thấy phân đoạn này có độc tính thấp khi cho chuột uống với liều 15 g/kg thể trọng chuột mà không có chuột nào chết. Vì vậy phân đoạn I được dùng thử tác dụng tăng cường miễn dịch.
Kết quả thử tác dụng tăng cường miễn dịch được trình bày ở các bảng từ 3.24 đến 3.31.
94
* Kết quả đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch
Trọng lượng tuyến ức tương đối
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của thuốc thử lên trọng lượng tuyến ức tương đối
Lô n Trọng lƣợng tuyến ức tƣơng
đối (X± SE, mg/g)
Lô 1: Chứng sinh học 8 4.17 ± 0.22
Lô 2: Mô hình CY 8 2.39 ± 0.22***
Lô 3: Chứng dương levamisol 8 1.89 ± 0.30***
Lô 4: PĐ I liều 100 mg/kg 8 1.75 ± 0.28***
Lô 5: PĐ I liều 300 mg/kg 8 1.80 ± 0.14***
Kết quả ở bảng 3.24 cho thấy: Trọng lượng tuyến ức tương đối ở lô mô hình (lô 2) giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (lô 1) với p ≤ 0.001. Trọng lượng tuyến ức ở các lô uống levamisol và PĐ I cả hai liều không có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình.
Số lượng bạch cầu:
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của thuốc thử lên số lượng bạch cầu
Lô n Số lƣợng bạch cầu
(X± SE, G/l)
Lô 1: Chứng sinh học 8 2.34 ± 0.12
Lô 2: Mô hình CY 8 1.21 ± 0.20***
Lô 3: Chứng dương levamisol 100 mg/kg 8 3.17 ± 0.63 ΔΔ
Lô 4: PĐ I liều 100 mg/kg 8 1.15 ± 0.25***
Lô 5: PĐ I liều 300 mg/kg 8 1.16 ± 0.13***
Kết quả trình bày ở bảng 3.25 cho thấy: CY làm giảm rõ rệt số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi của chuột. Levamisol 100 mg/kg có tác dụng làm tăng bạch cầu máu ngoại vi so với lô mô hình. PĐ I cả 2 liều không có tác dụng làm tăng bạch cầu máu ngoại vi so với lô mô hình (p > 0.05).
95
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ IgG máu ngoại vi
Lô n Nồng độ IgG
(X± SE, pg/ml)
Lô 1: Chứng sinh học 8 84.98 ± 0.55
Lô 2: Mô hình CY 8 77.20 ± 1.14***
Lô 3: Chứng dương levamisol 8 81.47 ± 0.62***Δ Lô 4: PĐ I liều 100 mg/kg 8 81.92 ± 0.34***Δ Lô 5: PĐ I liều 300 mg/kg 8 82.44 ± 0.49***Δ
Nhận xét: Kết quả bảng 3.26 cho thấy: CY làm giảm rõ rệt nồng độ IgG máu ngoại vi so với lô chứng sinh học (p < 0.001). Levamisol làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi so với lô mô hình. PĐ I cả 2 liều cũng có tác dụng làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi so với lô mô hình (p < 0.05).
* Kết quả đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào
+ Phản ứng bì với kháng nguyên OA:
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của thuốc thử đến phản ứng bì với kháng nguyên OA
Lô n Phản ứng bì
(X± SE, mm)
Lô 1: Chứng sinh học 8 2.95 ± 0.07
Lô 2: Mô hình CY 8 3.04 ± 0.10
Lô 3: Chứng dương levamisol 100 mg/kg 8 2.93 ± 0.11
Lô 4: PĐ I liều 100 mg/kg 8 2.96 ± 0.30
Lô 5: PĐ I liều 300 mg/kg 8 2.85 ± 0.29
Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.27 cho thấy không có sự khác biệt giữa các lô thử so với lô mô hình và so với lô chứng sinh học.
+ Định lượng các cytokin trong máu ngoại vi:
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của thuốc thử đến nồng độ IL-2
Lô n Nồng độ IL-2
(X± SE, pg/ml)
96
Lô 2: Mô hình CY 8 2.97 ± 0.46***
Lô 3: Chứng dương levamisol 100 mg/kg 8 7.21 ± 1.51 Δ
Lô 4: PĐ I liều 100 mg/kg 8 5.74 ± 0.97*Δ
Lô 5: PĐ I liều 300 mg/kg 8 7.52 ± 1.24 Δ
Nhận xét: Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.28 cho thấy: CY gây ra tình trạng giảm rõ rệt nồng độ IL-2 trong máu ngoại vi. Levamisol 100 mg/kg có tác dụng làm tăng nồng độ IL–2 so với lô mô hình. Nồng độ IL-2 ở lô uống levamisol không khác biệt so với nhóm chứng sinh học. PĐ I liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng nồng độ IL -2 so với lô mô hình (p < 0.05) nhưng vẫn thấp hơn so với nhóm chứng sinh học. PĐ I liều 300 mg/kg có tác dụng rõ rệt làm tăng nồng độ IL-2 so với lô mô hình, nồng độ IL-2 ở lô PĐ I liều 300 mg/kg không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học.
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của thuốc thử đến nồng độ TNF-α
Lô n Nồng độ TNF-α
(X± SE, pg/ml)
Lô 1: Chứng sinh học 8 5.01 ± 0.59
Lô 2: Mô hình CY 8 16.55 ± 2.75***
Lô 3: Chứng dương levamisol 100 mg/kg 8 8.33 ± 1.40* Δ
Lô 4: PĐ I liều 100 mg/kg 8 15.13 ± 3.82*
Lô 5: PĐ I liều 300 mg/kg 8 13.70 ± 1.31*
Nhận xét: Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.29 cho thấy: CY gây gia tăng rõ rệt nồng độ TNF-α trong máu ngoại vi của chuột nhắt. Levamisol 100 mg/kg có tác dụng làm giảm có ý nghĩa thống kê TNF-α so với lô mô hình (p < 0.05). PĐ I cả 2 liều không làm thay đổi có ý nghĩa thống kê nồng độ TNF-α so với lô chứng sinh học (p > 0.05).
+ Giải phẫu vi thể tuyến ức:
Bảng 3.30. Kết quả giải phẫu vi thể tuyến ức
Lô nghiên cứu Tuyến ức
Lô 1: Chứng sinh học Chuột số 2, số 3 và số 4: Mô tuyến ức bình thường Lô 2: Mô hình CY Chuột số 12, số 13 và số 14: Giảm số lượng lympho
97 bào tuyến ức Lô 3: Chứng dương
levamisol 100 mg/kg
Chuột số 22: Tuyến ức có giảm số lượng lympho bào. Chuột số 24: Tuyến ức có tăng lympho bào.
Chuột số 25: Tuyến ức gần như bình thường. Lô 4: PĐ I liều 100
mg/kg
Chuột số 53, 54: Tuyến ức giảm số lượng lympho bào. Chuột số 55: Tuyến ức giảm nhẹ số lượng lympho bào. Lô 5: PĐ I liều 300
mg/kg
Chuột số 72, 73 và 74: Tuyến ức giảm số lượng lympho bào.
(Hình ảnh về giải phẫu vi thể tuyến ức xem ở Phụ lục 23).
Nhận xét: PĐ I chiết xuất từ Phụ tử ở liều 100 mg/kg và 300 mg/kg thể trọng chuột,
uống liên tục trong 7 ngày có tác dụng kích thích miễn dịch, thông qua tăng đáp ứng miễn dịch dịch thể (tăng nồng độ IgG), tăng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (tăng nồng độ IL-2) và hạn chế một phần tổn thương tế bào miễn dịch tại cơ quan lympho trung ương (tuyến ức) trên mô hình gây suy giảm miễn dịch cấp bằng cyclophosphamid ở chuột nhắt trắng.
3.3.2.3. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn chứa flavonoid
Sau khi chiết xuất và thử độc tính cấp của phân đoạn chứa flavonoid (PĐ C) cho thấy phân đoạn này có độc tính thấp khi cho chuột uống với liều 12 g/kg thể trọng chuột mà không có chuột nào chết. Vì vậy PĐ C được thử tác dụng sinh học.
*Tác dụng bảo vệ gan của phân đoạn chứa flavonoid (PĐ C)
Để nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của phân đoạn chứa flavonoid, trong nghiên cứu này đã sử dụng mô hình gây tổn thương gan cấp bằng CCl4.Kết quả định lượng hoạt độ enzym ALT, AST và bilirubin được trình bày ở các bảng 3.31.
Bảng 3.31. Ảnh hưởng của PĐ C trên hoạt độ enzym ALT, AST và hàm lượng bilirubin huyết thanh chuột
TT Lô thí nghiệm Hoạt độ enzym ALT (U/l) Hoạt độ enzym AST (U/l) Hàm lƣợng bilirubin (µmol/l) X± SE Tỷ lệ giảm (%) X± SE Tỷ lệ giảm (%) X± SE Tỷ lệ giảm (%) 1 Chứng sinh lý (n= 8) 41.5 ± 8.1 148.2 ± 15.2 20.9 ± 1.3 2 Chứng bệnh lý 7125.8 ± 5641.2 ± 28.3 ±
98 (n=14) 587.5 397.4 1.3 3 PĐ C liều 10 mg/kg (n=14) 5999.5 ± 310.8 15.80 5375.2± 267.6 4.71 28.6 ± 1.3 -1.22 4 PĐ C liều 20 mg/kg (n=14) 5618.1 ± 340.6 * 21.16 5385.5 ± 284.8 4.53 28.6 ± 1.6 -1.11 5 PĐ C liều 30 mg/kg (n=14) 4330.6 ± 508.0 * 39.23 3824.1 ±386.8 * 32.21 26.2 ± 1.1 7.48 6 Silymarin (n=14) 4854.8 ± 501.0 * 31.87 4515.5 ± 251.9 * 19.95 24.5 ± 0.7* 13.42 Chú thích: *: p so với lô chứng bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê với p < 0.05
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.31 cho thấy phân đoạn dịch chiết flavonoid từ lá cây Ô đầu (PĐ C) có tác dụng làm giảm hoạt độ enzym AST và ALT phụ thuộc vào liều lượng. Ở liều 10 mg/kg thể trọng làm giảm hoạt độ enzym ALT 15.8 % và, AST 4.71 % so với lô chứng bệnh lý với p > 0.05. Khi tăng liều lên 20 mg/kg và 30 mg/kg thể trọng chuột thì sự giảm hoạt độ enzym ALT tăng lên rõ rệt là 21.16 % và 39.23 % so với lô chứng bệnh lý với p < 0.05. Tuy nhiên, đối với AST ở mức liều 20 mg/kg, sự giảm hoạt độ enzym AST chỉ 4.53 % (p > 0.05) trong khi ở mức liều 30 mg/kg thì giảm hoạt độ AST tới 32.21 % với p < 0.05. Tác dụng của phân đoạn chứa flavonoid liều 30 mg/kg trên hoạt độ enzym ALT, AST gần tương đương với silymarin liều 100 mg/kg thể trọng chuột. Qua số liệu thực nghiệm cũng cho thấy phân đoạn dịch chiết flavonoid với các liều 10 mg, 20 mg và 30 mg/kg thể trọng chuột không có tác dụng ức chế sự tăng hàm lượng bilirubin so với lô chứng bệnh lý. Trong khi đó silymarin liều 100 mg/kg làm giảm hàm lượng bilirubin rõ rệt so với chứng bệnh lý với p < 0.05. Như vậy phân đoạn chứa flavonoid từ lá cây Ô đầu có tác dụng làm giảm tổn thương gan do CCl4 gây ra, thể hiện qua giảm hoạt độ enzym so với nhóm chứng bệnh lý.
*Tác dụng chống oxy hoá của phân đoạn chứa flavonoid (Phân đoạn C)
Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của phân đoạn chứa flavonoid từ lá cây Ô đầu thông qua khả năng làm giảm hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan chuột thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.32.
99
Bảng 3.32. Hàm lượng MDA trong gan chuột
STT Lô thí nghiệm n Hàm lƣợng MDA (nmol/100mg gan) Tỷ lệ giảm so với 2 (%) p so với chứng bệnh lý 1 Chứng sinh lý 8 31.11 ± 1.49 2 Chứng bệnh lý 14 45.62 ± 2.34 p1,2< 0.01 3 PĐ C liều 10 mg/kg 14 45.76 ± 2.60 - 0.30 p2,4> 0.05 4 PĐ C liều 20 mg/kg 14 42.58 ± 2.46 6.66 p2,5> 0.05 5 PĐ C liều 30 mg/kg 14 38.34 ± 1.97 15.96 P2,6< 0.05 6 Silymarin 14 37.54 ± 1.52 17.70 p2,7 < 0.05
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.32 cho thấy: Phân đoạn chứa flavonoid (PĐ C) có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA trong quá trình peroxy hoá do CCl4 gây ra trên chuột nhắt trắng. Tác dụng giảm hàm lượng MDA phụ thuộc liều lượng. Với liều 10 mg và 20 mg/kg thể trọng chuột trong 8 ngày không có tác dụng làm giảm sự tăng hàm lượng MDA (p > 0.05), nhưng với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có tác dụng làm giảm sự tăng hàm lượng MDA trong gan rõ rệt (15.96 % ) so với lô chứng bệnh lý với p < 0.05. Tác dụng của liều 30 mg/kg tương đương với thuốc đối chứng silymarin liều 100 mg/kg thể trọng (15.96 % so với 17.7 %) với p > 0.05.
100
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
Các loài thuộc chi Aconitum đã được biết đến từ lâu, với tác dụng cường tim, chống viêm, giảm đau. Trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu về chi Aconitum. Tuy nhiên hiện nay các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu để tìm thêm những hợp chất mới, với những tác dụng khác nhau phục vụ công tác phòng và điều trị bệnh. Xu hướng chiết xuất, phân lập các hợp chất có tác dụng tốt để bào chế thành các dạng thuốc hiện đại thuận tiện cho việc sử dụng đang được quan tâm nhiều. Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, trong đó tác giả Bùi Hồng Cường đã nghiên cứu về cây Ô đầu trồng ở Sa Pa tỉnh Lào Cai theo hướng chế biến Phụ tử bằng phương pháp cổ truyền và thử tác dụng sinh học của nước sắc từ sản phẩm chế biến Phụ tử để tạo sản phẩm từ bài thuốc bát vị quế phụ. Tuy nhiên cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang đến nay chưa có nghiên cứu nào. Mặt khác, trong các điều kiện sinh thái khác nhau, một loài thực vật vẫn có sự thay đổi về hàm lượng, thành phần hóa học, tác dụng sinh học. Đặc biệt, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt đề án quy hoạch phát triển dược liệu đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030, trong đó cây Ô đầu sẽ được trồng và phát triển tại Hà Giang thành vùng nguyên liệu ổn định cung cấp cho ngành dược, đồng thời góp phần xóa đói giảm nghèo cho nhân dân địa phương. Vì vậy cần có nghiên cứu sâu về cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang theo hướng tạo tiền đề phát triển sản phẩm thuốc ứng dụng trên lâm sàng, góp phần phát triển vùng trồng cây Ô đầu một cách bền vững.
4.1.Về thực vật
Chi Aconitum là một chi lớn thuộc họ Ranunculacae với khoảng 331 loài, đặc
điểm thực vật giữa các loài khác nhau ở một số điểm nhất định. Chi này phân bố ở khu vực phía bắc ôn đới, khu vực lạnh ở bán cầu bắc, chủ yếu ở vùng núi Đông Á, Đông Nam Á, Trung Âu, một số ở phía tây bắc Mỹ [104]. Ở Việt Nam cũng ghi nhận cây Ô đầu có ở một số tỉnh vùng núi cao, khí hậu lạnh mát như: Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng. Đây là những tỉnh biên giới giáp với Trung Quốc. Cho đến nay, tại Trung Quốc đã ghi nhận chi Aconitum có khoảng hơn 200 loài. Theo một số tác giả, cây Ô đầu ở Việt Nam được cho là có nguồn gốc từ Trung Quốc, di thực vào Việt Nam từ những năm 70 thế kỷ trước. Tuy nhiên, tên khoa học cây Ô đầu trồng ở Việt
101
Nam ghi nhận dưới 2 tên là: A. carmichaeli Debx. và A. fortunei Hemsl [2], [6], [27]. Hiện nay trên thế giới, chi Aconitum ghi nhận có khoảng 948 loài nhưng số loài được chấp nhận chỉ có khoảng 331 loài [105], [153]. Do các loài thuộc chi Aconitum được đặt tên khác nhau và trước kia không công bố rộng rãi nên một loài lại có thể có nhiều tên khác nhau. Mặt khác căn cứ vào đặc điểm thực vật để phân loại cũng khó khăn, do đặc điểm giữa các loài khác nhau không nhiều, cùng một loài sống trong các điều kiện khác nhau, có thể có sự thay đổi về hình thái. Mẫu cây Ô đầu thu thập được tại Hà Giang cũng có đặc điểm của loài A. carmichaeli Debx. [89], đồng thời so sánh với mẫu tiêu bản cây Ô đầu thu thập trước kia, đang lưu tại Viện Dược liệu, đều có những đặc điểm của loài A. carmichaeli Debx. Các chuyên gia về thực vật của Viện Dược liệu (PGS.TS. Nguyễn Văn Tập, TS. Phạm Thanh Huyền) đã xác định cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang có tên khoa học là: A. carmichaeli Debx. họ Ranunculaceae.
Mặt khác, một số nước như Trung Quốc, Hàn Quốc đã xây dựng cơ sở dữ liệu về ADN của các loài thuộc chi Aconitum. Để góp phần khẳng định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang, ngoài nghiên cứu về đặc điểm hình thái thực vật, đề tài còn giám định ADN của mẫu cây này. Đối với cây Ô đầu trồng ở Việt Nam đây là lần đầu tiên, phương pháp giám định ADN được sử dụng để giám định tên khoa học của cây. Sau khi chiết xuất, phân tách ADN và giải trình tự gen của mẫu lá cây Ô đầu, cho kết quả trình tự gen như phụ lục 1. So sánh trình tự đoạn gen ITS1-5,8S- ITS2 này với trình tự gen đã công bố của loài A. carmichaeli Debx. [83] cho thấy có sự trùng