* Kỹ thuật miễn dịch sắc ký:
Tiến hành tại Phũng xột nghiệm Vi sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung Ương. Áp dụng phương phỏp miễm dịch enzyme sắc ký, phỏt hiện chọn lọc khỏng nguyờn C.trachomatis, bằng test thử nhanh dBest One Step CT test Strip của hóng AmeriTek (Mỹ). Đõy là phương phỏp kết hợp kết dớnh khỏng thể đơn dũng và khỏng thể đa dũng để tỡm khỏng nguyờn Lipopolysaccharides (LPS) của C.trachomatis.
• Nguyờn lý xột nghiệm:
Khỏng thể khỏng LPS đơn dũng cú gắn chất màu và khỏng thể khỏng LPS đa dũng (dờ) được gắn vào vạch thử nghiệm ở thanh thử để xỏc định khỏng nguyờn LPS của cỏc dũng C.trachomatis. Khỏng thể khỏng IgG chuột đa dũng gắn ở vạch kiểm tra.
Khi nhỏ mẫu bệnh phẫm đó được xử lý bằng dung dịch chiết tỏch LPS vào ụ trũn của thanh thử, hỗn dịch chảy qua giấy thấm, LPS được bắt giữ bởi khỏng thể đơn dũng LPS và chất tạo màu tạo thành phức hợp miễn dịch khỏng nguyờn- khỏng thể. Phức hợp này gắn với khỏng thể khỏng LPS đa dũng ở vạch thử nghiệm và hỡnh thành vạch màu tớm đỏ. Chất kết hợp màu thừa sẽ tạo phản ứng ở vạch kiểm tra với khỏng thể khỏng IgG chuột tạo thành vạch màu tớm đỏ thứ 2, điều này chứng tỏ thuốc thử hoạt động tốt.
• Vật liệu xột nghiệm:
Bộ test dBest One Step CT test Strip của hóng AmeriTek bao gồm: Hộp test, bảng hướng dẫn, dụng cụ lấy bệnh phẩm, dung dịch đệm xột nghiệm, ống nhựa để chứa dung dịch đệm và bệnh phẩm
• Lấy bệnh phẩm:
Lấy ở cổ tử cung sử dụng chẩn đoỏn Chlamydia. Trước khi lấy dựng bụng lau sạch nhầy ở CTC. Đưa tăm bụng vào lỗ trong CTC khoảng 1,5cm, xoay và miết nhẹ cho phần tăm bụng chạm vào thành CTC trong khoảng 10- 30 giõy để lấy tế bào biểu mụ ống CTC. Lấy tăm bụng ra chỳ ý khụng để tăm bụng chạm vào thành õm đạo.
• Bảo quản bệnh phẩm:
Bệnh phẩm nếu khụng được làm xột nghiệm ngay thỡ bảo trong điều kiện 2-8C.
• Tỏch chiết mẫu:
− Tất cả bệnh phẩm được đặt ở nhiệt độ phũng trước khi làm test
− Đỏnh dấu ống nghiệm cho mỗi bệnh nhõn và đặt lờn giỏ đỡ
− Nhỏ 6 giọt dung dịch đệm A vào ống nghiệm, đặt que tăm bụng vào và xoay nhẹ tăm bụng khoảng 15 giõy để trộn đều húa chất. Ủ ở nhiệt độ phũng khoảng 3 phỳt.
− Cho tiếp vào ống nghiệm 6 giọt dung dịch B, xoay nhẹ tăm bụng trong vũng 15 giõy.
− Vắt tăm bụng bằng cỏch ộp và miết vào thành ống nghiệm. Vứt bỏ tăm bụng.
− Xột nghiệm được thực hiện ngay hoặc để trong vũng 3 giờ ở nhiệt độ phũng mà khụng ảnh hưởng đến kết quả.
• Thực hiện test:
− Bỏ que test ra khỏi vỏ bao.
− Nhỳng que test vào dung dịch bệnh phẩm. Chỳ ý khụng để que ngập quỏ vạch tối đa.
− Đọc kết quả trong vũng 15 phỳt. Khụng đọc kết quả sau 15 phỳt.
• Đọc kết quả test:
− Khi bắt đầu cú phản ứng, sẽ cú một vạch màu xuất hiện ở phớa trờn của vạch kết quả. Vạch này được gọi là vạch Control (Vạch C).
− Vạch màu thứ 2 phớa dưới của thanh thử sẽ chỉ kết quả của test (Vạch T)
− Kết quả dương tớnh: Cú 2 vạch màu tại vị trớ kiểm chứng (C) và thử
nghiệm (T)
− Kết quả õm tớnh: Chỉ cú một vạch màu ở vạch kiểm chứng (C)
− Kết quả khụng cú giỏ trị: Khụng thấy vạch hồng nào xuất hiện hoặc chỉ
xuất hiện vạch hồng ở vạch (T). Cú thể do làm khụng đỳng hướng dẫn hoặc cú thể do test bị hỏng. Khi đú cần làm lại xột nghiệm.
• Hạn chế của test:
Mặc dự test tương đối chớnh xỏc trong việc phỏt hiện ra C.trachomatis. Tuy nhiờn vẫn cú tỷ lệ rất thấp là dương tớnh giả (Mỏu nhiều trờn que bệnh
phẩm cú thể làm cho kết quả dương tớnh giả). Cũng như cỏc xột nghiệm chẩn đoỏn khỏc, chẩn đoỏn xỏc định phải kết hợp khỏm lõm sàng và xột nghiệm cận lõm sàng.
* Kỹ thuật PCR
Được tiến hành tại phũng xột nghiệm sinh học phõn tử, Viện Da liễu Quốc gia. Bệnh phẫm lấy bằng tăm bụng ở CTC. Sau đú, tiến hành chiết tỏch DNA bằng Kit Qiamp DNA Mini Kit của hóng Qiagen theo đỳng hướng dẫn của hóng.
• Nguyờn lý:
DNA- C.trachomatis nếu cú trong tế bào (ở bệnh phẩm CTC) với một số lượng nhỏ sẽ được chiết tỏch, sau đú được tiếp xỳc với “mồi” (tức là cỏc đoạn DNA đặc trưng cho Chlamydia) và enzym DNA- polymerase để được sản xuất với lượng lớn hơn, đủ để phỏt hiện với cỏc kỹ thuật thụng thường, trong khi DNA của cỏc vi khuẩn khỏc khụng được khuếch đại về lượng vỡ thiếu “mồi”.
• Thành phần của phản ứng PCR Dung dịch đệm 10x dNTP 10mM MgCl2 Taq polymerase Dung dịch ADN Mồi xuụi Mồi ngược Nước khử ion
Tổng lượng dung dịch cho một lần khuếch đại là 50
Cỏc húa chất của phản ứng do hóng Bio- Rad- Hoa Kỳ sản xuất Riờng mồi được tổng hợp bởi Invitrogen- Hồng Kụng cú trỡnh tự như sau:
− Mồi chẩn đoỏn C.trachomatis thứ nhất
KL1: 5'TCC GGA GCG AGT TAC GAA GA 3' KL2: 5' AAT CAA TGC CCG GGA TTG GT 3'
− Mồi chẩn đoỏn C.trachomatis thứ hai
T1: 5' CTA GGC GTT TGT ACT CCG TCA 3' T2: 5' TCC TCA GGA GTT TAT GCA CT 3'
• Chu kỳ nhiệt
Biến tớnh DNA ở 9490C trong 2 phỳt.
Sau đú thực hiện 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tớnh DNA ở 940C trong 30 giõy, giai đoạn gắn mồi ở 550C trong 1 phỳt, giai đoạn kộo dài mồi ở 720C trong 30 giõy. Sau khi hoàn thành 35 chu kỳ, kết thỳc phản ứng ở 720C trong 5 phỳt.
• Phỏt hiện sản phẫm khuếch đại gen
Điện di sản phẩm trờn thạch agarose 1,5% trong dung dịch đệm. Bản thạch sau khi chạy điện di được ngõm trong dung dịch ethidium bromide 0,5àg/ml trong 30 phỳt rồi rửa qua nước cất. Xem và chụp ảnh bản thạch trong buồng tối dưới ỏnh sỏng cực tớm, cỏc băng DNA sẽ phỏt sỏng. So sỏnh kớch cỡ của sản với thang DNA chuẩn để kết luận sản phẩm đú cú đặc hiệu cho C.trachomatis hay khụng. Chẩn đoỏn C.trachomatis bằng cặp mồi KL1 và KL2