Áp dụng phương pháp nghiên cứu KST toàn diện ở cá của Dogiel (1929), có sửa chữa, bổ sung cho phù hợp với ựiều kiện khắ hậu của Việt Nam của tác giả: Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007).
2.6.3.1. Nguyên tắc nghiên cứu ký sinh trùng
Ờ Cá ựưa vào kiểm tra ký sinh trùng phải còn sống hoặc vừa mới chết, da còn nhớt.
Ờ Kiểm tra bằng mắt thường trước, bằng dụng cụ quang học sau. Ờ Kiểm tra các cơ quan bên ngoài trước, các cơ quan bên trong sau. Ờ Khi kiểm tra các cơ quan khác nhau thì dụng cụ cần phải ựược lau chùi sạch ựể tránh nhầm lẫn ký sinh trùng của cơ quan này sang cơ quan khác.
Ờ Tiến hành ựo và cân cá trước khi giải phẫu cá.
2.6.3.2. Kiểm tra và phát hiện ký sinh trùng
Trong quá trình kiểm tra ký sinh trùng tiến hành kiểm tra một số cơ quan: da, mang, ruột, dạ dày, gan, mật.
Kiểm tra ký sinh trùng ngoại kắ kinh
Kiểm tra da: Quan sát bằng mắt thường có thể phát hiện KST có kắch thước lớn như Lernaea, Argulus, bào nang của MyxobolusẦ Sau ựó tiến hành kiểm tra nhớt da (cạo ở gốc vây), ựặt nhớt cạo ựược lên lam nhỏ nước muối sinh lý, ựậy lamel rồi quan sát dưới kắnh hiển vi ở ựộ phóng ựại 4X ựể phát hiện ký sinh trùng.
Kiểm tra mang: Dùng kéo cắt bỏ xương nắp mang, quan sát bằng mắt thường và ghi lại những biểu hiện bất thường của mang. Sau ựó lấy nhớt mang cho lên 3 lam với cá lớn, còn cá nhỏ thì cạo hết nhớt cho lên 1 lam. đậy lamel rồi quan sát dưới kắnh hiển vi.
Kiểm tra ký sinh trùng nội kắ sinh
Sau khi kiểm tra da và mang xong tiến hành giải phẫu cá ựể kiểm tra cơ quan bên trong. đặt cá nằm trên khay men, dùng kéo nhọn mổ một ựường từ hậu môn lên phắa trước, cắt bỏ một bên vách bụng. Sau ựó dùng kéo nhọn cắt ruột sau ở sát hậu môn, ruột trước ở sát hầu ựể lấy toàn bộ nội tạng ra ngoài. Khi mổ cần chú ý nâng cao mũi kéo tránh làm tổn thương, vỡ nát nội tạng bên trong. Dùng panh tách riêng từng cơ quan ựể kiểm tra.
Ruột: Dùng kéo nhọn giải phẫu ruột, gạt bỏ thức ăn trong ruột, sau ựó cắt ruột ra thành 3 ựoạn (ruột trước, ruột giữa, ruột sau). Quan sát bằng mắt thường hay kắnh lúp tay có thể gặp trùng có kắch thước lớn như Cestoidea,
Acanthocephala, Trematoda, Cnidosporidia. Sau ựó lấy nhớt cho vào 3 lam quan sát trên kắnh hiển vi ựể phát hiện trùng có kắch thước nhỏ.
3.6.3.4. Phương pháp thu thập, cố ựịnh, bảo quản ký sinh trùng.
đối với mỗi loại ký sinh trùng khác nhau sẽ có phương pháp thu thập, cố ựịnh, bảo quản khác nhau.
Nguyên sinh ựộng vật Ờ Protozoa.
Khi quan sát thấy ở nhớt da, nhớt mang có nhiều KST thuộc ngành Protozoa cần tiến hành thu mẫu bằng phương pháp phết kắnh.
Phương pháp phết kắnh: lấy 2 lam, 1 cái chứa trùng, 1 cái sạch kéo nhẹ lên nhau sao cho lớp nhớt trên lam thật mỏng. Thả lam vào dung dịch Shadine khoảng 15 phút, lấy lam ra rửa qua nước cất rồi cho vào dung dịch cồn khoảng 10 phút. Sau ựó nhúng vào dung dịch cồn Iốt trong 10-15 phút, thao tác này có khả năng khử HgCl2 trong Shadine. Cuối cùng nhúng trong cồn vài phút. Sau khi cố ựịnh trùng ựược bảo quản trong cồn 700 ựựng trong lọ thủy tinh hình trụ có ựường kắnh lớn hơn ựường kắnh của lam. để tránh nhầm lẫn lam của cơ quan này với lam của cơ quan khác cần dán etyket ghi rõ cơ quan, ngày tháng, ựịa ựiểm thu mẫu.
Riêng KST thuộc giống Trichodina, Trichodonella tiến hành thu thập, cố ựịnh mẫu theo phương pháp ựơn giản hơn ựể nhuộm bằng AgNO3 2%. Lấy nhớt mang, da có nhiều trùng phết lên lam sạch và dán Etyket ựể tránh nhầm lẫn. Phết xong ựể lam khô tự nhiên, tránh ruồi, muỗi ựậu vào. Sau khi lam khô dùng giấy cuốn các lam lại cho gọn, giữa các lam có xếp giấy ngăn cách. Mẫu cố ựịnh theo phương pháp này có thể bảo quản ựược 10-15 ngày.
Sán lá song chủ - Digenea.
Dùng panh và dùi nhỏ tách trùng ra khỏi tổ chức cơ thể, ựưa vào hộp lồng có nước muối sinh lý rửa sạch. đặt trùng lên lam, dùng lamel ép mỏng. Sau ựó cố ựịnh trùng bằng dung dịch Bouin trong thời gian 6 Ờ 8 h, cuối cùng bảo quản trong cồn 700.
3.6.3.5. Phương pháp làm tiêu bản.
Mỗi loại ký sinh trùng khác nhau có phương pháp làm tiêu bản khác nhau. đây là thao tác rất quan trọng.
Nguyên sinh ựộng vật Ờ Protozoa.
Mẫu tiến hành thu thập theo phương pháp phết kắnh ựược nhuộm bằng 2 loại hóa chất là Hematoxylin và AgNO3.
Nhuộm bằng Hematoxylin: dùng ựể nhuộm KST ựơn bào (Protozoa) như: Apiosoma, Hemiophays. Thao tác nhuộm như sau:
Ờ Làm trùng no nước: ngâm trùng qua các thang cồn có nồng ựộ nhỏ dần 700, 500, 300, 100. Mỗi thang ựể 10 Ờ 20 phút.
Ờ Cho trùng vào dung dịch Feric sulfattamoni 4%, bộ tiêm mao trùng (Ciliata) ngâm 2 Ờ 4h, bộ tiên mao trùng (Flagellata) ngâm 6 Ờ 10h. Sau ựó rửa nước cất 2 lần, mỗi lần 5 phút.
Ờ Cho vào dung dịch Hematoxylin 2 Ờ 10 phút ựể trùng bắt màu. Rồi rửa qua nước 30Ỗ- 1h.
Ờ Nếu trùng bắt màu quá ựậm có thể làm nhạt màu bằng cách rửa qua dung dịch Feric sulfattamoni 4%, khi nào thấy trùng có màu xanh tro hoặc màu xanh tắm thì lấy ra. Rửa qua nước chảy nhẹ 1 Ờ 2h.
Ờ Làm mất nước bằng cách cho qua các thang cồn có nồng ựộ cao dần: 100, 300, 500, 700, 900, 1000, cồn Ờ Xylen (1:1), Xylen.
Ờ Cuối cùng gắn tiêu bản bằng Bom Canada.
Nhuộm bằng AgNO3 2%: dùng ựể nhuộm ký sinh trùng thuộc giống
Trichodina, Tripartiella, Paratrichodina. Ưu ựiểm của phương pháp này là vòng răng trên cơ thể thấy rõ, thuận lợi cho quá trình phân loại. Các bước thực hiện:
Ờ Lấy lamen có trùng xếp một lượt vào ựĩa lồng có dung dịch AgNO3 2%, chú ý lamen ngập trong dung dịch AgNO3 2% .
Ờ Lấy mẫu ra rửa bằng nước cất nhiều lần. Tiếp tục ngâm mẫu trong nước, ngập 1 Ờ 1,5cm, ựem phơi nắng 30 Ờ 60 phút tùy theo cường ựộ ánh sáng mặt trời.
Ờ Rửa lại bằng nước cất nhiều lần, dựng nghiêng cho khô. Ờ Gắn tiêu bản bằng Bom Canada, tránh ựể có bọt.
Ờ Cuối cùng chọn tiêu bản ựẹp lưu lại.
Sán song chủ (Digenea), sán dây (Cestoidea). Các thao tác thực hiện:
Ờ Làm trùng no nước: ngâm trùng qua các thang cồn có nồng ựộ nhỏ dần 700, 500, 300, 100, 00. Mỗi thang ựể 15 Ờ 20 phút.
Ờ Cho trùng vào dung dịch nhuộm Carmin trong thời gian 1 Ờ 3giờ. Theo dõi dưới kắnh hiển vi khi nào thấy tầng bì cơ thể có màu ựỏ, các cơ quan bên trong có màu ựỏ ựậm, nhạt không giống nhau.
Ờ Nếu trùng bắt màu quá ựậm làm nhạt bằng cách nhúng trùng trong dung dịch cồn acid (cồn 800 và HCL 0.5%).
Ờ Nhúng trùng và rửa qua nước chảy nhẹ 1giờ.
Ờ Làm mất nước bằng cách cho qua các thang cồn có nồng ựộ cao dần: 100, 300, 500, 700, 900, 1000, cồn Ờ Xylen (1:1), Xylen. Mỗi thang giữ khoảng 15 phút. Thang cồn 900, 1000 giữ trùng càng lâu càng tốt hoặc thay cồn 2 lần.
Ờ Dùng panh gắp trùng ựặt lên lam sạch, gắn tiêu bản bằng Bom Canada.
Ờ Dán nhãn, ghi rõ tên trùng, cơ quan ký sinh, ựịa ựiểm và thời gian thu mẫu.
2.6.3.6. Phương pháp ựo và ựếm ký sinh trùng.
Phương pháp ựếm ký sinh trùng.
để xác ựịnh CđN và TLN ta cần phải ựếm số lượng KST.
Ký sinh trùng có kắch thước lớn như Nematoda, Lernaea,
các cơ quan kiểm tra.
Ký sinh trùng có kắch thước nhỏ chỉ quan sát dưới dụng cụ quang học, ựếm số lượng trùng có trên một lamel hoặc nếu số lượng trùng quá nhiều ta ựếm trên một thị trường kắnh 10x10 như Trichodina.
Phương pháp ựo kắch thước ký sinh trùng.
Kắch thước cơ thể và kắch thước một số cơ quan trên cơ thể trùng là một ựặc ựiểm ựể phân loại ựến giống, loài ký sinh trùng. Sử dụng thước ựo Micromet ựể ựo trùng và các cơ quan của trùng.
2.6.3.7. Phương pháp phân loại ký sinh trùng.
Căn cứ phân loại.
để tiến hành phân loại KST cần dựa vào một số ựặc ựiểm phân loại: hình dạng, cấu tạo cơ thể trùng, cấu tạo, kắch thước và vị trắ cơ quan kắ sinh, kắch thước các nội quan. Tuy nhiên mỗi lớp KST khác nhau lại có những căn cứ phân loại khác nhau.
Trùng bánh xe: căn cứ vào hình dạng, cấu tạo, số lượng răng và ựường phóng xạ ựể phân loại. Kắch thước, cấu tạo của răng bám cũng là một căn cứ phân loại ựể phân loại trùng bánh xe.
Sán lá song chủ (Digenea): căn cứ vào hình dạng, cấu tạo của cơ thể. Hình dạng, cấu tạo của cơ quan bám, vị trắ và tỷ lệ về kắch thước của cơ quan bám (giác bụng và giác miệng) là căn cứ ựể phân loại Digenea. Ngoài ra hình dạng, vị trắ, kắch thước buồng trứng, tinh sào, noãn hoàng cũng là một căn cứ phân loại quan trọng.
Tài liệu phân loại.
Trong quá trình phân loại chúng tôi sử dụng một số tài liệu phân loại sau: Protozoan parasites of Fishes, Jiri Lom và Dykova (1922)
Khu hệ kắ sinh trùng cá nước ngọt của Liên Xô, Bychowsky (1982- 1986).
Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam, Hà Ký, Bùi Quang tề (2007).