- Gây bệnh tắch tế bào:
Chhương 2 đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.6. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng paraffin, nhuộm Hematoxyline - Eosin (HE)
Cố ựịnh bệnh phẩm
- Mục ựắch: Giết chết tổ chức
- Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý bệnh phẩm phải ngập trong formol), ựể sau 7-10 ngày là có thể dùng ựược (cắt mẫu bệnh phẩm không thấy máu chảy ra là ựược).
Vùi bệnh phẩm
- Mục ựắch: tạo chất nền cho tổ chức dễ cắt. - Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 - 5mm. Xâu các miếng tổ chức vào 1 sợi chỉ mảnh và rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h ựể rửa sạch formol.
Khử nước và khử cồn
- Mục ựắch: Khử hết nước và cồn trong tổ chức.
- Ngâm lần lượt các miếng tổ chức trong các bình dung dịch sau: Cồn I: 3 giờ.
Cồn II: 3 giờ. Cồn III: 4 giờ Cồn IV: 12 giờ. Xylen I : 4 giờ. Xylen II: 4 giờ. Xylen III: 12 giờ.
Khử xylen
- Mục ựắch: khử hết xylen trong tổ chức, ựể paraffin thấm ựều trong các kẽ mô bàọ
- Ngâm lần lượt các miếng tổ chức trong hệ thống paraffin ở 560C Paraffin I: 6 giờ.
Paraffin II: 6 giờ. Paraffin III: 12 giờ.
đúc block
- Mục ựắch: ựể vùi miếng tổ chức trong môi trường paraffin thuần nhất tạo thành 1 thể thống nhất.
- Tiến hành:
đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block ựổ nhanh paraffin lỏng vào block.
đặt khuôn ựã ựúc sang băng khô ựể làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng, ựặc và chắc là ựược.
Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn rồi gắn nhãn ựể tránh nhầm lẫn.
Cắt dán mảnh
- Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với ựộ mảnh cắt khoảng 3 -5ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
- Tãi mảnh: Sau khi cắt ựược, dùng panh kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước, hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 480C rồi lấy kắnh vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược.
Nhuộm tiêu bản
- Bước 1: Khử paraffin
Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 30 phút
Xylen II: 30 phút Xylen III: 30 phút Lau hết phần xylen quanh tiêu bản. - Bước 2: Khử xylen
Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn I: 10 phút
Cồn II: 10 phút Cồn III: 10 phút - Bước 3: Khử cồn
Cho tiêu bản ựể dưới vòi nước chảy khoảng 10 phút. - Bước 4: Nhuộm Hematoxyline (nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ Hematoxyline ngập tiêu bản. để trong khoảng 8-10 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước khoảng 10 phút. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựị Kiểm tra màu sắc.
Nếu thấy tiêu bản xanh tắm là ựược.
Nếu tiêu bản vẫn còn nhạt màu thì phải nhúng tiêu bản vào lọ cồn acid (cồn 960C + HCl) trong 30 giâỵ Sau khi ựiều chỉnh ựược màu rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
- Bước 5: Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 12 - 15 phút tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 10 phút cho hết eosin thừạ Sau ựó lau khô phần xung quanh tiêu bản.
- Bước 6: Tẩy nước
Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ Cồn I: 15 giây
Cồn II: 15 giây Cồn III: 15 giây
- Bước 7: Tẩy cồn, làm trong tiêu bản
Cho tiêu bản lần lượt ựi qua ba lọ xylen I, II, III trong thời gian 1 giâỵ Sau ựó cho tiêu bản vào lọ xylen ựã ựể sẵn trong tủ ấm 370C trong 2 phút.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoàị
đánh giá kết quả
đem soi tiêu bản trên kắnh hiển vi quang học ở vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.