Việc xác định nitrite bằng phương pháp này trải qua 2 giai đoạn: giai đoạn điazo hóa tạo ra ion điazoni và giai đoạn ghép cặp tạo hợp chất màu. Để thuận tiện cho quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian điazo hóa và ghép cặp tối ưu trước bằng cách cố định các thông số khác, khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình điazo hóa và ghép cặp.
Lấy chính xác 2,0 ml nitrite 10 μg/ml (0,8 μg/ml), 1,0 ml DAP, 1,0 ml HCl 2 M, sau đó khảo sát thời gian điazo hóa. Tiếp theo thời gian này, ta thêm 2,5 ml αnaphthol để phản ứng ghép cặp xảy ra trong 15 phút. Định mức và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ= 538 nm. Dung dịch so sánh cũng được chuẩn bị tương tự như dung dịch đo nhưng không có nitrite. Kết quả sự thay đổi mật độ quang như hình sau:
Nhận xét: Quá trình điazo hóa cần phải có thời gian. Khi tăng thời gian
đó mật độ quang tăng dần. Tuy nhiên, nếu để thời gian điazo hóa kéo dài mà không kịp thời cho ghép cặp thì ion điazoni sẽ bị thủy phân [18]. Do vậy khi khảo sát thời gian điazo hóa (hình 3.3), chúng tôi nhận thấy sự biến đổi của mật độ quang như sau: thời gian đầu tăng dần, rồi ổn định và sau đó giảm theo thời gian. Cụ thể là:
Khi thời gian điazo hóa tăng từ 1 ÷ 3 phút, mật độ quang A tăng dần từ 0,630 đến 0,648, độ lệch của A từ 1 ÷ 3 phút ∆A= +2 ,86 %.
Trong khoảng từ 3 ÷ 7 phút, mật độ quang A ổn định và có giá trị cao nhất. Độ chênh lệch mật độ quang trong khoảng này là rất nhỏ, ∆A chỉ có +0,31% là rất tốt.
Nhưng khi kéo dài thời gian điazo hóa, từ 7 phút trở đi mật độ quang A bắt đầu giảm dần, đến 15 phút giảm xuống còn 0,625, độ lệch mật độ quang 15 phút so với 7 phút là ∆A= -3,85%. Điều đó đã chứng tỏ ion điazoni đã bị thuỷ phân 1 phần do đó hiệu suất ghép cặp giảm đi và nồng độ của chất màu tạo thành cũng giảm theo. Thời gian điazo hóa càng tăng thêm thì mật độ quang càng giảm.
Từ kết quả và nhận xét trên, chúng tôi nhận thấy: để quá trình điazo hóa diễn ra với hiệu suất cao và tiết kiệm thời gian trong phân tích thì khoảng thời gian cho giai đoạn điazo hóa từ 3 ÷ 7 phút là thích hợp. Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian điazo hóa là 5 phút để khảo sát tiếp theo.