2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.6. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
- Thu mẫu cây Ô rô tím (Acanthus ilicifoliusL.) từ2 địa điểm (địa điểm 1 và 2) tại rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh (bao gồm thân, lá, hoa và quả).
- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện ở phòng thí nghiệm Vi Sinh vật – Khoa Sinh học – Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh.Các mẫu thử được kí hiệu như sau:
Bảng 2.2. Ký hiệu cao chiết của hai dạng Ô rô tím
STT Dạng Kí hiệu
1 Ô rô lá không gai OR 2 Ô rô lá có gai ORG 2.3.6.1. Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính
-Rửa sạch mẫu, sau đó mẫu cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 2-3cm.
-Tiến hành sao trên bếp lửa cho đến khi vàng, khô, hạ thổ và sử dụng giấy báo khô để gói lại.
A B
Hình 2.8.Hạ thổ mẫu Ô rô sau khi sao vàng (A) và cao khô được cho vào các lọ thủy tinh (B)
-Lấy 30g mẫu khô hòa với 500ml nước cất đem đun sôi nhỏ bằng nồi đấtđể nước sắc lại trong khoảng thời gian 90 phút.
-Sau đó chế nước sắc vào khay thủy tinh, phân biệt hai loạivà bỏ vào tủ sấy khô ở 60PoPC cho đến khi khối lượng không đổi.
-Cao khô được cho vào các lọ thủy tinh, có ghi nhãn, đậy kín và bảo quản trong tủ lạnh ở 5PoPC.
2.3.6.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Dụng cụ, thiết bị
-Nồi hấp vô trùng (ALP, Nhật Bản) -Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)
-Tủ sấy (Memmert, Đức) -Tủ lạnh (Hitachi, Nhật Bản)
-Cân phân tích điện tử (Sartorius, Nhật Bản)
-Dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, que cấy, que trang thủy tinh, đèn cồn, bông,…
Chuẩn bị môi trường
Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: MHA - Mueller Hinton Agar dạng bột mua từ công ty Merck, được pha vào nước cất theo tỉ lệ của nhà sản xuất, hấp vô trùng ở 121PoPC, 1 atm trong 15 phút tại phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa trường Đại Học Sư Phạm Tp. HCM.
Thành phần môi trường (g/l):
Acid Casein Pepton (H): 17,50
Starch: 1,50
Beef Infusion: 2,00 Bacteriological Agar: 17,00
pH: 7,4±0,2
Các đĩa pêtri được rửa sạch và sấy vô trùng ở 180PoPC trong 30 phút.Đổ môi trường MHA (khoảng 12 - 15ml) sau khi đã hấp vô trùng vào đĩa pêtri trong tủ cấy vô trùng, để yên cho môi trường nguội, yêu cầu mặt thạch phải phẳng và có độ dày khoảng 2mm, sau đó bao gói và để ở nhiệt độ phòng 2 ngày để kiểm tra, đảm bảo môi trường không bị nhiễm khuẩn, nấm.
Chuẩn bị chủng vi khuẩn thử nghiệm
Chúng tôi lựa chọn các chủng vi khuẩn thử nghiệm đại diện cho cả hai nhóm Gram (-) và Gram (+), đồng thời căn cứ vào khả năng trị bệnh của Ô rô tím theo kinh nghiệm dân gian.
Các chủng vi khuẩn kiểm định đại diện cho vi khuẩn Gram dương:
- Bacillus subtilis
- Staphylococcus aureus
Các chủng vi khuẩn kiểm định đại diện cho vi khuẩn Gram âm:
- Pseudomonas aeruginosa - Escherichia coli
Các chủng vi khuẩn thử nghiệm bao gồm cả Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Escherichia coli từ Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, được cấy truyền bằng phương pháp thạch nghiêng trên môi trường MHA và được thử nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy.
Định lượng chủng vi khuẩn thử nghiệm
Đây là phương pháp giúp kiểm soát được số lượng tế bào vi khuẩn cấy vào mỗi đĩa petri môi trường, đảm bảo số lượng vi khuẩn là tương đương nhau khi thử hoạt tính của các cao khác nhau, qua đó có thể so sánh độ mạnh yếu về hoạt tính giữa các cao thử nghiệm.
Chúng tôi sử dụng kết hợp phương pháp đo độ đục và phương pháp đếm khuẩn lạc để thiết lập mối tương quan hồi quy tuyến tính giữa độ đục và nồng độ tế bào vi khuẩn (còn gọi là đường chuẩn):
- Đổ 5ml nước cất vô trùng vào ống nghiệm chứa vi khuẩn thử nghiệm, dùng que cấy vô trùng gạt khẽ vào bề mặt thạch để hòa vi khuẩn vào nước tạo thành dịch huyền phù. Hút dịch huyền phù vi khuẩn sang ống nghiệm vô trùng khác, sau đó lấy một nửa dịch huyền phù để đo các giá trị độ đục bằng máy đo OD, nửa còn lại để pha loãng và cấy lên đĩa môi trường.
- Dùng nước cất vô trùng pha loãng dịch huyền phù vi khuẩn và giá trị OD ở bước sóng 610nm sao cho đạt được 1 dãy các giá trị OD lân cận: 0,1; 0,2;
0,3; 0,4; 0,5; 0,6. Ghi chép lại tỷ lệ dịch huyền phù và nước cất cần pha loãng để đạt được các giá trị OD trên.
- Pha loãng nửa dịch huyền phù còn lại tương ứng với các giá trị OD từ 0,1
0,6 theo tỷ lệ dịch chứa vi khuẩn/nước cất vô trùng trong ống
3TEppendorf3Tvô trùng.
- Tiếp tục pha loãng dịch huyền phù tương ứng từng giá trị OD đến nồng độ 10P-4P, 10P-5P.
Hình 2.9. Cách pha loãng dịch vi khuẩn
- Hỳt 20àl dịch vi khuẩn ứng với từng giỏ trị OD sau khi đó pha loóng đến nồng độ 10P-4P, 10P-5 Pnhỏ lên đĩa môi trường, dùng que cấy tam giác vô trùng trang đều dịch vi khuẩn ra khắp bề mặt thạch, ghi lại giá trị OD cùng nồng độ pha loãng lên đĩa, lặp lại 3 lần cho mỗi giá trị OD. Bao gói lại và để ở nhiệt độ phòng, nơi khô ráo trong 24 giờ, sau đó lấy ra đếm số khuẩn lạc trên đĩa:
+ Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường
+ Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 – 300 + Dùng bút để đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm
+ Tính toán kết quả bằng công thức:
RN=X � ∗𝟓𝟎𝒂
Trong đó:
N là số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1ml (CFU/ml) X là số khuẩn lạc trung bình (3 đĩa petri)
Alà nồng độ pha loãng mẫu (10P-4P, 10P-5P, …)
- Xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ CFU/ml và độ đục của dịch huyền phù của chủng vi khuẩn thử nghiệm.
Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết
Xác định hoạt tính kháng khuẩn các cao OR và ORG bằng phương pháp đục lỗ thạchcủa Bauer và cộng sự [25], [33].
+ Hỳt 20àl dịch huyền phự chủng vi khuẩn thử nghiệm cú số lượng tế bào vi khuẩn khoảng 10P5P (tương đương 5*10P6P CFU/ml) nhỏ vào đĩa môi trường và trang đều mặt thạch cho đến khi khô bằng que trang thủy tinh vô trùng.
+ Dùng khoan nút chai vô trùng đường kính 9mmđục một lỗ thạch giữa đĩa petri.
+ Nhỏ vào lỗ thạch 100àl dung dịch cao chiết từ cỏc thực vật ngập mặn.
Lặp lại 3 lần với mỗi loại cao thử nghiệm.
+ Bao gói và để vào tủ lạnh ở nhiệt độ 5P0PC trong 3 giờ cho thuốc thử khuếch tán vào môi trường. Sau đó, lấy ra và để ở nhiệt độ phòng 8 giờ rồi kiểm tra, đo đường kính vòng vô khuẩn, chụp hình và ghi lại kết quả.
Đánh giá độ mạnh của hoạt tính căn cứ vào:(D-d)mm, với D là đường kính vòng vô khuẩn, d = 9mm là đường kính lỗ thạch.
Quy ước:
(D-d) ≥ 25mm: Hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh (D-d) ≥ 20mm: Hoạt tính kháng khuẩn mạnh (D-d) ≥ 15mm: Hoạt tính kháng khuẩn trung bình
(D-d) < 15mm: Hoạt tính kháng khuẩn yếu