1.2. KHÁI QUÁT VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM
1.2.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization_IVF) là quá trình kết hợp giữa tinh trùng (giao tử đực) với trứng (giao tử cái) để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ - trong phòng thí nghiệm với môi trường sinh học nhân tạo có các điều kiện thích hợp: nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, yếu tố dinh dưỡng, pH, áp suất thẩm thấu… cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải được đảm bảo bình thường gần giống như trong cơ thể mẹ. [5, 8, 28]
Quy trình IVF gồm những bước cơ bản: thu nhận và chọn lọc giao tử đực và cái; thụ tinh; nuôi hợp tử phát triển thành phôi; cấy truyền phôi tươi hoặc phôi đông lạnh cho con cái nhận phôi. Mỗi bước trong quy trình đều đóng vai trò quan trọng như nhau nhằm đảm bảo được khả năng hình thành và phát triển phôi tối đa.
Nguồn trứng sử dụng cho IVF có thể thu từ những động vật sống được kích hoạt bằng kích dục tố để gây rụng trứng hàng loạt; từ buồng trứng động vật giết mổ hay sử dụng trứng đông lạnh. Theo Long và cs. (1993), các nang trứng có đường kính 2-8 mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc thu nhận các trứng chưa trưởng thành phục vụ cho kĩ thuật IVF. Trong kĩ thuật IVF, nếu sử dụng các trứng chưa trưởng thành cần có sự hỗ trợ của quá trình nuôi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM). Ngoài ra, sử dụng trứng đông lạnh trong quá trình IVF cũng là một thử thách lớn vì tỉ lệ thụ tinh và phát triển phôi không cao do những tổn thương khó phục hồi ở màng nội chất và màng thụ tinh của trứng trong quá trình bảo quản. [8, 28]
Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các trứng đã được thực hiện với tinh tươi hoặc tinh đông lạnh qua giải đông. Ở nhiều phòng thí nghiệm, do khó khăn trong bảo quản lạnh nên tinh tươi vẫn là nguồn tinh trùng chính cho các nghiên cứu IVF. Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tươi có một số thành phần không có lợi cho hoạt động của tinh trùng. Mục đích của các phương pháp thu nhận tinh trùng theo các nghiên cứu nhằm chọn được các tinh trùng bình thường có độ di động tốt, loại được các tế bào chết, các vi sinh vật và các chất độc, hoạt hóa đầu tinh trùng, tạo thuận lợi cho quá trình thụ tinh với trứng. [13]
Hệ thống thụ tinh IVF đòi hỏi nghiêm ngặt về các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, thời gian thụ tinh, áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy. Hầu hết các môi trường IVF cần bổ sung những yếu tố có vai trò hoạt hóa tinh trùng, tăng khả năng hoạt động của chúng. Ngoài ra, cũng bổ sung những yếu tố cần thiết giúp chúng duy trì khả năng thụ tinh. Bên cạnh đó, môi trường IVF cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ thụ tinh đa tinh trùng. Martinez-Mardrid và cs. (2001) đã sử dụng hai
môi trường IVF khác nhau gồm môi trường đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi trường Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh. Kết quả này cho thấy, trong mTALP tinh trùng có tỉ lệ xâm nhập cao hơn (92-94% so với 61-67%). Vì thế, lựa chọn môi trường IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng để giảm tối thiểu tỷ lệ đa tinh trùng nhưng đạt tỉ lệ thụ tinh cao. [28, 31, 39]
1.2.2.2. Sự phát triển của phôi trong điều kiện in vitro
Trong điều kiện in vitro với môi trường chứa dịch muối cân bằng, các cơ chất cung cấp năng lượng và protein và điều kiện môi trường 5% CO2 và ở 38,5oC, trứng bò sau khi thụ tinh vẫn có khả năng phát triển bình thường. Sau khi thụ tinh, hợp tử phân chia bằng cách nguyên phân liên tục sau mỗi 24 giờ, tạo thành các tế bào phôi. Cũng là quá trình nguyên phân nhưng nguyên phân ở tế bào phôi khác ở các tế bào sinh dưỡng là sau mỗi lần phân chia kích thước tế bào phụi gần bằng ẵ kớch thước tế bào mẹ trước đú. Như vậy, sau mỗi lần phõn chia, số lượng tế bào phôi tăng lên trong khi đó kích thước phôi tổng thể không thay đổi. Hơn thế nữa, mỗi tế bào phôi sẽ tự thiết lập một chương trình phát triển riêng để chuẩn bị cho sự biệt hóa thành các dòng tế bào chức năng cho cơ thể. [28, 39]
• Giai đoạn trứng hai tiền nhân: khoảng 16 – 18 giờ sau khi thụ tinh một trong hai tiền nhân chứa thông tin di truyền từ trứng và phần còn lại chứa thông tin di truyền từ tinh trùng. Tính phân cực của tiền nhân và sự phân phát của hạch nhân giữa hai tiền nhân cho thấy chất lượng tiềm tàng của phôi đang trên đà phát triển.
Cuối cùng hai tiền nhân sẽ biến mất, hợp tử bây giờ đang trong giai đoạn chuyển thành phôi. [21, 23]
• Giai đoạn phôi hai tế bào: Sau 18-20 giờ thụ tinh, hợp tử sẽ bắt đầu chu kỳ phân chia đầu tiên thành hai tế bào. Sự phân chia được thực hiện trên trục và mặt phẳng phân chia lấy thể cực thứ hai làm mốc. [33, 35]
• Giai đoạn phôi bốn tế bào và tám tế bào: Chu kỳ phân chia tế bào thứ hai xảy ra với mặt phẳng phân chia nằm vuông góc tại vị trí xích đạo của trục phân chia thứ nhất. Kết thúc giai đoạn này, phôi tạo thành 4 tế bào có kích thước tương đối bằng nhau (42-54 giờ sau khi thụ tinh). Chu kỳ phân bào tiếp tục diễn ra. Vào
ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, người ta có thể quan sát được phôi ở giai đoạn 8 tế bào. [28, 35]
• Giai đoạn phôi dâu (morula) và phôi nang (blastocyst): Sau ngày thứ 4 các tế bào phôi bắt đầu mất dần ranh giới giữa chúng. Màng tế bào phôi trở nên khó phân biệt, lúc này phôi có hình dạng và kích thước rất khác nhau giai đoạn này gọi là giai đoạn nén (compaction). Ở giai đoạn này, phôi được gọi là phôi dâu.
Giai đoạn tiếp theo là sự hình thành khoang phôi (cavitation) khoảng 100 giờ sau khi thụ tinh. Khoang phôi tích lũy dịch ngày càng nhiều và lớn dần, kích thước của khối tế bào bên trong (Inner Mass Cell _ICM) trở nên nhỏ và bắt đầu nén chặt, lớp tế bào nuôi phôi (Trophectoderm Cell _TE) cũng giảm dần kích thước sau lần phân chia và dẹp hơn. Phôi ở giai đoạn này gọi là phôi nang khoảng ngày thứ 6 đến 8 sau thụ tinh. [5, 8, 34, 35]
Giai đoạn 2 tiền nhân Phôi 2 tế bào Phôi 4 tế bào
Phôi 8 tế bào Phôi dâu Phôi nang
Hình 1.1. Các giai đoạn phát triển của phôi
1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến phôi in vitro
Tạo phôi in vitro là một lĩnh vực tiềm năng của công nghệ sinh học sinh sản trong việc tăng nguồn giống gia súc và là một công cụ quan trọng cho những nghiên cứu về phôi học. Tuy nhiên, có một số dấu hiệu cho thấy rằng vẫn có những khác biệt về hình thái và cấu trúc phân tử của phôi giữa việc tạo thành phôi in vivo và in vitro. Điều này có thể do các nhân tố như chất lượng nang trứng, trứng, môi trường nuôi phôi, thời gian thụ tinh…
• Kích thước nang trứng
Bình thường, sự trưởng thành của trứng bên trong nang trứng đòi hỏi một thời gian dài. Trong suốt giai đoạn đó, trứng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết để thực hiện quá trình giảm phân tạo thành trứng trưởng thành cho quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi sau này. Do đó, chất lượng của trứng liên quan chặt chẽ đến thành phần trong nang trứng. Có nhiều báo cáo cho thấy có một mối liên hệ giữa kích thước nang trứng và khả năng của trứng.
Một số báo cáo cho thấy rằng những trứng thu từ những nang có đường kính hơn 2-3mm sẽ cho những phôi có tỷ lệ phát triển tốt (Yang và cs., 1998). Ngược lại, những trứng thu từ những nang có đường kính nhỏ hơn có tỷ lệ phát triển rất thấp, do những nang trứng chưa tích tụ đầy đủ những chất cần thiết cho trứng trải qua quá trình giảm phân. [4, 5, 28]
• Thời gian thụ tinh
Cơ hội thụ tinh và sự phát triển sẽ tốt hơn nếu tiến hành thụ tinh cho trứng khoảng 4 giờ sau khi hình thành thể cực đầu tiên. Ở các động vật như chuột, nếu thụ tinh muộn, trứng thường có cực đầu to và phôi phát triển không bình thường.
• Mật độ tinh trùng
Trong quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, người ta không thể xác định được chính xác tỷ lệ tinh trùng thực sự được hoạt hóa. Do đó, để đảm bảo cho sự thụ tinh thành công, tinh trùng thường được sử dụng với một lượng rất lớn.
Trong điều kiện nuôi cấy thông thường, mật độ tinh trùng vào khoảng 105-106 tinh trùng/ml hoặc 104-105 tinh trùng/trứng. Tuy nhiên, điều này sẽ gây ra tỷ lệ thụ
tinh đa tinh trùng trong điều kiện in vitro cao hơn nhiều lần so với trong điều kiện in vivo. [11]
• Loại tinh trùng chết ra khỏi môi trường sau thụ tinh [9, 10, 17]
Theo các nghiên cứu cho thấy, sự hiện diện của tinh trùng chết trong môi trường sau thời gian thụ tinh sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi. Do đó, cần chuyển tế bào trứng cùng với tinh trùng bám vào màng thụ tinh ra khỏi phần tinh trùng đã chết để tránh tác động oxy hóa của các sản phẩm trao đổi chất của tinh trùng lên sự phát triển của phôi.
1.2.2.4. Hệ thống đánh giá phôi sau khi thụ tinh
Có nhiều hệ thống đánh giá phôi sau khi thụ tinh, thường tiêu chuẩn hình thái được sử dụng để đánh giá chất lượng của phôi bao gồm: [28, 31]
- Số lượng tế bào phôi
- Kích thước, hình dạng, sự đối xứng, màu sắc bào tương của các tế bào phôi - Tỷ lệ xuất hiện các mảnh vỡ tế bào trong bào tương