1.3.3.1. Ảnh hưởng do quá trình thủy tinh hóa
Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng của trứng. Trong đó, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công. Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích. Trứng dễ bị tổn thương bởi quy trình đông lạnh do các nguyên nhân: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào. Vì vậy, việc đông lạnh chúng là rất khó khăn (Vincent và Johnson, 1992). [49]
Bên cạnh đó, phương pháp thủy tinh hóa dường như đe dọa đến sự sống sau đông lạnh do nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế bào (Hotamisligil và cs., 1996) [25]. Ngoài ra, chất lượng trứng sau thủy tinh hóa còn phụ thuộc các yếu tố như: những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đông lạnh và rã đông gây ra; đặc điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đông lạnh (A.Bernard và B.J.Fuller, 1996) [11]. Kết quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đông lạnh có thể bị tác động bởi trạng thái trưởng thành của chúng, chất lượng hay các yếu tố lý sinh trong quy trình đông lạnh đã sử dụng. Ví dụ, khi trưởng thành, chất lượng và kích thước trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến kết quả đông lạnh.
[26]
Trứng ở giai đoạn Metaphase II dễ bị tổn thương lạnh do có đặc thù là DNA của nó được giữ trên thoi vô sắc giảm phân và toàn bộ nằm trong tế bào chất, không được bảo vệ trong màng nhân, mà thoi vô sắc nơi nhiễm sắc thể bắt đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp. Làm lạnh trứng trong thời gian ngắn ở 20oC có thể gây ra sự phá vỡ không phục hồi bộ máy thoi vô sắc trong khi sự khử nước xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thấp hơn 0oC. Lúc này khả
năng sống của chúng đã giảm mạnh và hệ thống thoi vô sắc neo giữ nhiễm sắc thể (NST) bị phân tán. Do đó, NST có thể không phân ly, hậu quả là tình trạng lệch bội lẻ hay đa bội xảy ra ở phôi hình thành sau khi trứng đông lạnh được thụ tinh. Sự đứt gãy bộ xương tế bào dẫn tới bộ xương tế bào bất bình thường, giữ lại thể cực thứ hai, thay đổi cấu tạo và các bào quan. [29, 41, 47, 48]
Các vi ống của trứng có thể bị tổn thương do chất bảo quản đông lạnh và sự thay đổi của nhiệt độ (Pickening và cs., 1976 [40]; Van Blerkom và Davis, 1994) [47] . Tổn thương thoi vô sắc giảm phân (meiotic spindle) có thể thay đổi vị trí nhiễm sắc thể và hậu quả là giới hạn khả năng thụ tinh của trứng (Eroglu và cs., 1998) [20]. Liên quan đến khả năng thụ tinh không chỉ do tổn thương thoi vô sắc mà còn do khả năng bất thường của nhiễm sắc thể (Aman và Parks, 1994) [9]. Trứng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với các chất bảo quản đông lạnh khác nhau. Johnson và Pickening (1987) [26] cho thấy trường hợp trứng tiếp xúc lâu với DMSO cho kết quả là không tập trung thoi sắc và nhiễm sắc thể bị phân tán.
Vincent và cs. (1990) cũng phát hiện ra DMSO có ảnh hưởng lên trứng. Tuy nhiên, họ đã kết luận tổn thương là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đó chất bảo quản đông lạnh không thể thấm vào tế bào một cách nhanh chóng và vì vậy rất ít chất bảo quản đông lạnh trong tế bào. [48]
1.3.3.2. Polyvinylpyrplidone (PVP)
Một trong các nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả của ICSI là nồng độ Polyvinylpyrolidone (PVP), một polimer được sử dụng để làm chậm tinh trùng tạo điều kiện cho ICSI. Năm 1997, Gordon và Carroll đã khảo sát nồng độ của PVP ảnh hưởng đến kết quả ICSI trứng bò. Kết quả ghi nhận là có sự ảnh hưởng của các nồng độ PVP lên sự hình thành phôi, nhưng sự ảnh hưởng của các nồng độ không đáng kể. Tuy nhiên, độ nhớt của PVP đã làm ảnh hưởng đến áp lực hút và đẩy tinh trùng trong injection pipette, điều này làm tổn hại đến trứng cũng như không đảm bảo được thời gian thực hiện thao tác. [28, 50]
1.3.3.3. Injection pippete
Thiết bị tiên quyết được dùng trong ICSI là injection pipette. Injection pipette phải đảm bảo có đường kính đủ lớn để hút tinh trùng, đủ nhỏ để chứa một lượng môi trường tối thiểu cũng như giảm thiểu tổn thương cho trứng và có đầu đủ nhọn để đâm thủng màng thụ tinh và màng noãn bào. Sự thụ tinh và phát triển của trứng sau ICSI phụ thuộc vào đường kính trong (ID) và đường kính ngoài (OD) của ịnection pippette. Với đường kính đảm bảo sẽ tạo điều kiện tốt cho thao tác và giảm thiểu sự tổn thương của trứng về cơ học cũng như lượng môi trường đưa vào trứng là tối thiểu từ đó giảm khả năng phát triển xa hơn của phôi. [28, 50]
1.3.3.4. Nuôi phôi
Trứng sau khi vi tiêm đã bị tổn thương màng do tác động cơ học của quá trình tiêm, đồng thời phôi tạo ra rất mỏng manh nên yêu cầu về điều kiện môi trường nuôi cấy, chất hoạt hóa, pH phải được kiểm soát một cách chặt chẽ để đảm bảo cho sự phát triển bình thường của phôi. [28]
CHƯƠNG II