Thí nghiêm được bố trí ngẫu nhiên giữa các dòng lúa được chọn làm thí nghiệm. Trong đó, giống lúa IR 28 hoặc IR 29 được chọn làm giống chuẩn nhiễm và giống Đốc Phụng được chọn làm giống chuẩn kháng.
Cách tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của lúa ở giai đoạn mạ:
Bước 1: Tiến hành ngâm (lúa được ngâm trong nước ấm với nhiệt độ 540C, tương ứng với 3 sôi 2 lạnh) trong vòng 24 giờ. Sau đó, lúa được ủ tiếp tục trong vòng 48 giờ.
Bước 2: Chuẩn bị khây nhựa 5 lít và miếng xốp được đục lỗ sẵn (mỗi miếng được đục 10 hàng mỗi hàng 10 lỗ)
20
Bước 3: Sau khi, lúa vừa nảy mầm cho vào khây, mỗi lỗ để 2 hạt lúa/lỗ (tương đương 20 hạt/dòng). Cho nước cất vào khây đúng 3 lít.
Bước 4: Sau 3 ngày, tiến hành thay nước muối (có dinh dưỡng) với nồng độ mong muốn, mỗi ngày đều chuẩn pH=5 và thêm nước để dung dịch trong khây đúng 3 lít.
Bước 5: Cứ 8 ngày sẽ thay dung dich muối (có dinh dưỡng )
Đến khi, giống chuẩn nhiễm ở cấp 9 (chết hoàn toàn) thì tiến lấy chỉ tiêu và đánh giá cấp.
Bảng 2.6 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ chịu mặn (IRRI, 1997)
Cấp Triệu chứng Đánh giá
1 Cây phát triển bình thường, không có triệu chứng trên lá Chống chịu tốt 3 Cây phát triển tương đối bình thường nhưng chóp lá hoặc
phân nửa của lá có vết trắng
Chống chịu 5 Phát triển chậm lại, hầu hết lá bị cuốn, chỉ có một vài lá
có thể kéo dài ra Chống chịu trung
bình 7 Ngưng phát triển, hầu hết những lá khô đi, một vài chồi bị
chết Nhiễm
9 100% số cây bị chết hoặc khô Rất nhiễm
Nguồn: IRRI,1997
2.3.4 Phương pháp điện di protein thành phần (Albumin) Bước 1: Chuẩn bị mẫu
+ Lấy 5 mg bột nội nhũ (không có phần phôi) nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml.
+ Thờm 35 àl dung dịch petrolium vào và trữ lạnh 1-2 giờ. Sau đú lấy ra phơi dưới gió khoảng 1h.
+ Thờm 30 àl dung dịch Albumin, để yờn trong tủ lạnh khoảng 1-2 giờ.
+ Ly tâm lạnh 14000 vòng/phút trong 15 phút.
Bước 2: Làm gel
Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuôn làm gel mà thể tích mỗi gel thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra Bảng tương quan giữa lượng và phần gel để xác định thành phần các dung dịch.
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide và gel cô mẫu 5% Polyacrylamide theo quy trình của Sambrook (1989):
+ Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide.
21
+ Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch A, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều rồi cho vào bộ gel.
+ Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để 30-60 phút gel sẽ đông.
+ Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylamide.
+ Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
+ Cài răng lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm một giọt nước.
Để 30-60 phút gel sẽ đông, loại bỏ răng lược, lắp vào khung điện di, cho dung dịch điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.7 Công thức pha dung dịch tạo gel (Sambrook, 1989)
Hóa chất (1gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml) Nước cất
30% Acrylamide 1,5M Tris H (pH= 8,8) 1M Tris HCl (pH=6,8) 10% SDS
10% Amonium persulfate TEMED
1,6 2 1,3 - 0,1 0,05 0,002
0,68 0,17 - 0,13 0,04 0,01 0,001
Bước 3: Tiến hành điện di
+ Bơm 10àl dung dịch ly trớch mẫu/giếng.
+ Chạy điện di với hiệu điện thế 20V ở gel cô mẫu và 40V ở gel phân tách.
Bước 4: Nhuộm và rửa gel
+ Gel được nhuộm trong hai giờ bằng dung dịch nhuộm Coomassie 0,2%
Brilliant Blue R250.
+ Rửa gel trong dung dịch acid acetic: methanol: nước theo tỷ lệ 20:05:75, hoặc rửa trong microwave trong 30 phút.
Bước 5: Đọc kết quả, scan và bảo quản gel.
22
Bước 6: Uớc lượng trọng lượng Protein (polypectide)
+ Dùng thước đo chiều dài di chuyển của thuốc nhuộm và chiều dài di chuyển của Protein (polypeptide), tính giá trị Rf.
+ Rf=khoảng cách di chuyển của Protein (polypeptide)/ khoảng cách di chuyển của thuốc nhuộm.
+ Đổi giá trị chiều dài di chuyển tương đối của Protein (polypeptide) chuẩn, chuyển trọng lượng sang dạng logarith và xác định khối lượng phân tử Protein (polypeptide) cần biết.