3.1 Studien zur Substratspezifitọt in trans-AT Polyketid-synthasen
3.1.3 Analyse der Bacillaen KS 2 Substratspezifitọt fỹr die γ,δ-Position
Abbildung 60: Ausschnitt aus Bacillaen-PKS, KS 2 prozessiert ein in α,β-Position vollstọndig reduziertes Substrat, Rot: γ,δ-Position.
3.1.3.1 Synthese der SNAC-Substrate
Das natürliche Substrat 72 wurde über etablierte Methoden der Peptidsynthese hergestellt. Zunọchst wurde die Sọure 80b mit γ-Aminobutansọureethylester (131b) zum Amid 132a in 83% Ausbeute verknỹpft (Abbildung 61). Anschlieòend wurde der Ester 132a zur Sọure 132b mit 90% in vergleichbaren Ausbeuten zur Literatur verseift.107 Die mit EDC-HCl initiierte Reaktion der Sọure 132b mit dem Thiol 120 ergab das Zielsubstrat 72 in 82% Ausbeute.
Abbildung 61: Synthese des SNAC-Thioesters 72.
Durch eine Johnson-Orthoester-Umlagerung wurde der Alkohol 133 in den Ester 135a überführt (Abbildung 62).108,109 Die Literaturausbeute von 90% wurde dabei reproduziert. Der Ester 135a wurde anschlieòend unter basischen Bedingungen zur Sọure 135b in 92% Ausbeute entschỹtzt, die anschlieòend mit CDI katalysiert in 65% in die Zielverbindungen 73 überführt wurde.98,107
Abbildung 62: Synthese des Thioesters 73.
Die Johnson-Orthoester-Umlagerung ist eine Variation der Claisen-Umlagerung, mit der in einem Syntheseschritt aus preiswerten Edukten direkt die geforderte C6-Kettenlọnge aufgebaut und die trans-konfigurierte Doppelbindung in der γ,δ-Position installiert wurde.109 Unter saurer Katalyse wird zunọchst der Triethylorthoester (134) durch die Reaktion mit dem Allylalkohol 133 in den gemischten Orthoester 139 überführt (Abbildung 63). Unter baseninduzierter Abspaltung von Ethanol wird der Orthoester zum Allyl-Vinylether 140 eliminiert. Durch die mit Wọrme initiierte [3,3]-sigmatrope Umlagerung des Intermediats 140 wird der Ester 135a gebildet. Dabei wird das Gleichgewicht zugunsten des Esters 135a verschoben, indem das wọhrend der Reaktion entstehende Ethanol kontinuierlich destillativ entfernt wird.
56 ERGEBNISSE und DISKUSSION
Abbildung 63: Mechanismus der Johnson-Orthoester-Umlagerung zur Synthese des Esters 135a.
Durch die Oxidation des kommerziell erhọltlichen Alkohols 141 mit Pyridiniumdichromat (PDC) wurde der Aldehyd 142 in 90% Ausbeute dargestellt (Abbildung 64).110,111 Trotz der hohen Toxizitọt des PDC wurde es aufgrund der einfachen Reaktionsbedingungen, der schnellen Aufarbeitung und der Anwendbarkeit im Multigrammansatz verwendet. Anschlieòend wurde durch eine Wittig-Reaktion mit dem Ylid 143a der Aldehyd 142 in den α,β-ungesọttigten Ester 144 ỹberfỹhrt, der anschlieòend Palladium-katalysiert zum gesọttigten Ester 145a hydriert wurde.97,112 Die Stereoselektivitọt bezỹglich der Doppelbindungskonfiguration kann prinzipiell durch die Reaktionsbedingungen und das verwendete Ylid gesteuert werden. Jedoch geht durch die anschlieòende Hydrierung der Doppelbindung die Stereoinformation im Molekỹl verloren, sodass die Stereoselektivitọt der Wittig-Reaktion vernachlọssigt wurde. Die basenkatalysierte Entschỹtzung ergab die Sọure 145b mit 98% in sehr guter Ausbeute.107 Der Thioester 74 wurde durch die mit CDI induzierte Reaktion der Sọure 145b mit N-Acetylcysteamin (120) in 69% Ausbeute dargestellt.98
Abbildung 64: Synthese des δ-Methoxythioesters 74; PDC: Pyridiniumdichromat.
Die kommerziell verfỹgbare (R)-3-Hydroxybuttersọure (119a) wurde zunọchst analog der Literaturvorschrift mit 75% Ausbeute in den Methoxymethylester 146a überführt.113 Das bei der Reaktion in situ generierte Dimsyllithium deprotoniert beide azide Gruppen der Hydroxysọure 119a, ohne dabei das Stereozentrum zu racemisieren. Weiterhin zeichnet sich diese Synthese durch sehr gute Ausbeuten aus. Die mit LiOH katalysierte Entschỹtzung ergab die Sọure 146b mit 65% in moderaten Ausbeuten. Die Polaritọt der kurzkettigen Sọure 146b und der daraus resultierenden Hydrophilie fỹhrte wahrscheinlich bei der wọssrigen Aufarbeitung dazu, dass ein Teil des Substrats 146b in der wọssrigen Phase verblieb. Im letzten Schritt wurde die Sọure 146b durch die CDI katalysierte Reaktion mit dem Thiol 120 in den Thioester 75 mit 57% Ausbeute überführt.
Abbildung 65: Synthese des β-Methoxysubstrats 75; n-BuLi: n-Butyllithium, DMSO: Dimethylsulfoxid.
3.1.3.2 Untersuchung der Bacillaen KS 2
Bei der Inkubation der Bacillaen KS 2 mit dem natürlichen Substrat 72 wurde keine Acylierung beobachtet (Tabelle 3). Interessanterweise wurde das verkürzte Analogon 68 von der KS 2 akzeptiert (Abbildung 66, Tabelle 3). Die NMR-Spektren des Thioesters 72 zeigten keine nennenswerten Verunreinigungen, sodass andere Effekte die Acylierung beeinflussen mỹssen (siehe Anhang Abbildung 148, Abbildung 149). Denkbar wọre aus chemischer Sicht eine Dimerisierung des Substrats 72 über Wasserstoffbrücken- bindungen der Hydroxygruppe mit einer Carbonylfunktion, sodass der Thioester 72 nicht mehr in die Bindungstasche passt. Einen ọhnlichen Effekt kửnnten komplexierte Ionen am Substrat 72 verursachen. Beweise wurden hierfür aber nicht gefunden. Das Substrat 72 wurde als Racemat synthetisiert. Aus biologischer Sicht kửnnten die Enantiomere konkurrieren, sodass das Enzym kompetitiv gehemmt wird.
Die Ergebnisse der Inkubation mit dem δ-Ketosubstrat 67, dem γ,δ-ungesọttigten Thioester 73 und dem δ-Methoxyderivat 74 zeigten, dass die Substratspezifitọt distal der β-Position signifikant abfọllt (Abbildung 66, Tabelle 3). Alle in der γ,δ-Position modifizierten Substrate 67, 73 und 74 wurden von dem Enzym akzeptiert. Jedoch ist anhand der initialen Acylierungsraten ersichtlich, dass weitreichende Wechselwirkungen die Spezifitọt der KS leicht beeinflussen. Das γ,δ-ungesọttigte Substrat 73 acylierte im
58 ERGEBNISSE und DISKUSSION
Vergleich zu den in δ-Position verzweigten Thioestern 67 und 74 schneller die KS 2.
Wahrscheinlich ist der Einfluss der reduzierten Flexibilitọt im ungesọttigten Substrat 73 niedriger als der Einfluss der sterischen Hinderung durch die δ-Verzweigung in den Thioestern 67, 74. Der Vergleich der Acylierungsraten der Moleküle 67 und 74 zeigte, dass die planare Verzweigung im Ketothioester 67 einen geringeren Einfluss als die sp3-hybridisierte Verzweigung im Methoxysubstrat 74 hat.
Abbildung 66: Zeitaufgelửste Acylierung der Bacillaen KS 2 mit den Substraten 59, 62, 67, 68, 73-75.
Tabelle 3: Initiale Acylierungsraten der Bacillaen KS 2 mit den Substraten 59, 62, 67, 68, 72-75; N.D.: keine detektierbare Acylierung wọhrend der Inkubation; * SNAC-Thioester, der das natỹrliche Substrat imitiert, geschọtzter Fehler: ± 0.005•10-6 mol dm-3 s-1.
Substrat Initiale Acylierungsrate
[mol dm-3 min-1]
59 0.3
62 0.7
67 0.3
68 0.2*
72 N.D.*
73 0.5
74 0.1
75 N.D.
Durch Inkubation der KS 2 mit den kurzkettigen Substraten 59, 62 und 75 wurde gezeigt, dass die KS 2 proximal zur γ-Position Substratspezifitọt aufweist. Sowohl das aliphatische Analogon 59, als auch das β-Ketosubstrat 62 acylierten das Protein, das β-Methoxyderivat 75 hingegen nicht. Die sterische Hinderung in dem verzweigten
t / min
[Acyl-Bae KS2] / àM
62f
ff
73 67f 59 68 74
75
Substrat 75 ist zu groò, sodass es nicht in die Bindungstasche passt. Interessanterweise wird das β-Ketosubstrat 62 von dem Enzym akzeptiert. Dabei ist die initiale Acylierungsrate von 62 mehr als doppelt so groò als die des Butyrylthioesters 59, der die Struktur des natürlichen Intermediats bis zur γ-Position imitiert. Der β-Ketothioester 62 kann durch Keto-Enol-Tautomerie sowohl als Wasserstoffbrückenbindungsdonor in der Enol-Form 147, als auch als Akzeptor in der Keto-Form 62 fungieren (Abbildung 67).
Anhand der Analyse der Bacillaen KS 1 wurde nachgewiesen, dass Interaktionen zwischen Aminosọuren in direkter Nachbarschaft des aktivierten Cysteins und des β-Stickstoffatoms im Substrat 64a die Acylierung unterstützen (s. Kapitel 3.1.2). Ähnliche Wechselwirkungen kửnnten auch die Acylierung des Substrats 62 beeinflussen.
Abbildung 67: Keto-Enol-Tautomerie des β-Ketothioesters 62.
Fazit: Die Untersuchung der Bacillaen KS 2 ergab, dass die Substratspezifitọt distal der β-Position signifikant relaxiert. Alle in der γ,δ-Position derivatisierten Substrate 67, 68,
73, 74 acylierten das Protein. Jedoch deuteten die initialen Acylierungsraten der Substrate 67, 68, 73, 74 darauf hin, dass weitreichende Substrat-Protein- Wechselwirkungen vorhanden sind, die die Spezifitọt des Enzyms beeinflussen. Mit den Substraten 59, 62, 75 wurde bestọtigt, dass die Spezifitọt der untersuchten KS 2 bis zur β-Position stark ausgeprọgt ist.