NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu
- Thu 120 mẫu máu của 120 cá thể người Khmer.
- Phân tích mẫu bao gồm các bước tách chiết ADN, định lượng ADN, nhân bội ADN, điện di trên máy điện di mao dẫn, kết quả lập đƣợc bảng kiểu gen của các mẫu nghiên cứu.
- Xử lý số liệu thống kê, kiểm định tần suất kiểu gen giữa kết quả thực tế và tính toán lý thuyết với độ tin cậy p = 0,05. Tính toán và đƣa ra bảng tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler cho 120 cá thể người Khmer.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Luận văn sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau - Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia.
- Phương pháp điều tra khảo sát thực tế, thu đại diện ngẫu nhiên mẫu, đảm bảo các điều kiện theo định luật Hardy - Weinberg.
- Phương pháp thực nghiệm khoa học: phân tích kiểu gen 120 cá thể theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự.
- Phương pháp thống kê số liệu sinh học để tính tần suất các alen trong hệ Identifiler của dân tộc Khmer.
Luận văn sử dụng các kỹ thuật sau
- Thu mẫu máu: dùng kim chích đầu ngón tay và thấm lên giấy FTA.
- Kỹ thuật tách chiết ADN dùng chelex 100.
- Kỹ thuật PCR và định lƣợng ADN bằng hệ thống Realtime PCR.
- Kỹ thuật điện di mao quản 2.2.1. Thu mẫu
Thu mẫu máu của 120 cá thể người Khmer theo nguyên tắc ngẫu nhiên, không có quan hệ họ hàng huyết thống:
- Thu mẫu ngẫu nhiên ở nhiều địa phương khác nhau.
- Quan sát hình thái học (người dân tộc Khmer có các đặc điểm nhân chủng học đặc trƣng).
- Kiểm tra giấy tờ tùy thân (chứng minh thƣ nhân dân, giấy khai sinh...).
- Hỏi trực tiếp người được thu mẫu.
- Dùng kim chích đầu ngón tay và thấm trực tiếp vào giấy FTA.
- Mẫu thu phải đảm bảo chất lƣợng, không bị lẫn, nhiễm, phơi khô tự nhiên, đóng gói riêng rẽ, ghi ký hiệu cho mẫu từ KM1 đến KM122 (hai mẫu bị hỏng).
2.2.2. Phân tích mẫu
2.2.2.1. Quy trình phân tích ADN
Chúng tôi tiến hành phân tích theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự đã đƣợc chuẩn hóa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b của Luật Giám định tư pháp 2012, gồm các bước sau:
Tách chiết ADN (phương pháp vô cơ)
Định lƣợng ADN
(phương pháp Real-time PCR)
(PCR) (bộ Kit Identifiler)
Điện di mao quản (Máy AB3130)
Phân tích kết quả
2.2.2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
a. Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN
STT Tên hoá chất thiết bị
1 5%
2 Block nhiệt khô cho ống 1,5ml (1000C) kèm nhiệt kế 3 Máy li tâm ống 1,5ml 14.000v/p
4 Tủ an toàn sinh học 5 Ống tách chiết 1,5ml
6 Cỏc đầu tớp 10àl, 200àl và 1000àl cựng pipet tương ứng b. Hóa chất và thiết bị cho định lƣợng ADN
STT Tên hoá chất thiết bị
1 Quantifiler Human DNA quantification Kit (hãng Applied Biosystems)
2 Optical plate 96 well 3 Optical seal
4 Máy Realtime PCR 7500 (hãng Applied Biosystems)
5 Cỏc loại đầu tớp 10 àl, 200 àl và 1000 àl cựng pipet tương ứng c. Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di
STT Tên hoá chất thiết bị
1 Máy giải trình tự Applied Biosystems 3130 2 Máy PCR 9700 96 well Applied biosystems 3 Kit Identifiler của hãng Applied biosystems 4 POP 4 (ABI)
5 Liz 500 Gene scan 6 HIDI formamide
7 Buffer 10X for AB - 3130 8 Capilary 3130 (36cm x 50ul) 9 Optical plate 96 well
10 Septa
11 Ống PCR (0,25 ml) và điện di (0,5 ml)
12 Cỏc loại đầu tớp 10 àl, 200 àl và 1000 àl cựng pipet tương ứng.
2.2.3. Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen
- Weinberg hay không [9, 13, 40]?
Do
không? [3, 40]
khảo sát
2 [2, 40].
theo phương pháp kiểm định 2 ta dùng chỉ số sau :
(2.1) .
* nij là số kiểu gen AiAj quan sát đƣợc trong một locus gen.
* Eij là số kiểu gen AiAj tính toán theo lý thuyết. Eij = npi2 nếu i=j, Eij = 2npipj nếu i ≠ j (2.2).
Tra giá trị 2 lý thuyết trên bảng theo hệ số tự do:
k(k-1)/2 (2.3)
Quy tắc kiểm định 2 là trong một locus gen số lƣợng kiểu gen quan sát dưới 5, thì phải kết hợp các alen bên cạnh để tăng số lượng quan sát cao hơn 5 để tính toán.
2.2.3.3. Các bước tính toán thống kê và kiểm định
- 120 kiểu gen của 120 cá thể ng-ời Khmer đ-ợc thống kê tần số kiểu gen, tÇn sè alen.
- .
- khảo sát (số lƣợng kiểu gen AiAj
cho từng locus ).
- Eij (số lƣợng kiểu gen AiAj cho từng locus đƣợc giả thiết tuân theo định luật Hardy - Weinberg).
- Tính chỉ số kiểm định 2 theo công thức.
- Xác định ( α =0.05 (tra
bảng).
-
2
[2, 3, 4, 13, 10].
Trong chương này chúng tôi đã trình bày các bước thu thập và bảo quản mẫu đúng với qui trình tiên tiến tại các phòng thí nghiệm giám định ADN của các nước trên thế giới. Cùng với đó là qui trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự đã đƣợc chuẩn hóa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b Luật Giám định tƣ pháp 2012.
Sử dụng phương pháp thống kê phổ biến trong nghiên cứu Sinh học, do quần thể nghiên cứu lớn nên chọn phương pháp kiểm định 2 là phù hợp.