Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2 Phương pháp phân tích mẫu
3.2.2 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô
Cắt tỉa định hướng
Do tôm lớn hơn 3cm nên cắt tôm ra thành những phần nhỏ tại các vị trí khác nhau như: mang, gan tụy, cơ. Sau đó lấy những phần nhỏ của tôm cho vào khuôn nhựa xử lý mẫu.
Xử lý mẫu
Tiếp theo quá trình cắt tỉa định hướng là quá trình xử lý mẫu. Qui trình xử lý mẫu mô tôm được cài đặt trong máy xử lý mẫu (Microm, STP 120-2) theo các bước sau (Shreck & Moyle, 1999)
Kích cỡ khối mô/Thời gian T
T
Hóa chất sử dụng
>=5mm <5mm <3mm <1mm
1 Cồn 80% 30’ 20’ 10’ 5’
2 Cồn 95% 60’ 20’ 10’ 5’
3 Cồn 95% 30’ 30’ 10’ 5’
4 Cồn 100% 60’ 40’ 20’ 5’
5 Cồn 100% 180’ 40’ 20’ 5’
6 Cồn 100% 180’ 40’ 20’ 5’
7 Cồn 100% 180’ 60’ 30’ 5’
8 Xylen 30’ 20’ 20’ 5’
9 Xylen 30’ 30’ 20’ 5’
10 Paraffin + Xylen (7:3) 60’ 60’ 20’ 5’
11 Paraffin + sáp ong (1:1) 60’ 60’ 30’ 5’
12 Paraffin + sáp ong (7:3) 60’ 60’ 30’ 5’
Sau khi hoàn thành bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số 1 và cho chương trình cài đặt trên vận hành theo chương trình 4 (program 4).
Đúc khối
Sau khi xử lý, chuyển khuôn nhựa chứa mẫu sang vị trí số 2 của máy đúc khối (Microm, EC 350-1). Để khối mô trong paraffin khoảng 30’, sau đó tiến hành đúc khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C. Định hướng mẫu mô, cẩn thận cho paraffin nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí thì Footer Page 25 of 126.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
19
cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định vị trí của mẫu trong khuôn.
Khi mẫu mô được tẩm vào trong paraffin, đặt khuôn nhựa có ký hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua máy làm lạnh nhanh (Microm, EC 350-2) để paraffin rắn lại, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn.
Cắt lát mẫu mô
a. Chuẩn bị máy cắt (Microtome, Yamato, PR-50)
Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-300. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có một lát cắt được hình thành.
b. Cắt mẫu
Trước khi tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dầy của lát cắt. Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 12-16 m. Sau khi đã cắt khối mẫu đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt ở cỡ 4 m.
Dán lát cắt vào phiến kính (lame) Chuẩn bị dụng cụ và dung dịch
- Phiến kính (lame)
- Nước ấm nhiệt độ khoảng 400C
- Bàn sấy (Slide warmer, PS-53) nhiệt độ khoảng 500C Phương pháp dán mẫu
Sử dụng nước ấm khoảng 400C, cho lát cắt vào chậu nước ấm. Sau khi lát cắt giãn thẳng trong chậu nước, nhúng phiến kính vào ngay bên dưới lát cắt, cẩn thận đính một đầu lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính ra khỏi nước, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Sau khi dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu bản bằng bàn sấy ở nhiệt độ 500C để loại bỏ paraffin.
Nhuộm màu
Chuẩn bị dung dịch - Xylen.
- Cồn (65%,90%,95%,100%).
- Nước cất.
- Dung dịch nhuộm Haematoxylin.
- Dung dịch Eosin.
Footer Page 26 of 126.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
20
Phương pháp nhuộm màu bằng Hematoxylin và Eosin (H&E) theo quy trình của Harris (1990) có điều chỉnh và mẫu được nhuộm thủ công
STT Hóa chất sử dụng Thời gian
1 Xylen 10 phút
2 Xylen 10 phút
3 Xylen 10 phút
4 Cồn 100% 1 phút
5 Cồn 100% 1 phút
6 Cồn 100% 1 phút
7 Cồn 95% 1 phút
8 Cồn 90% 1 phút
9 Cồn 65% 1 phút
10 Nước máy 1 phút
11 Haematoxylin. 2 phút
12 Nước máy 1 phút
13 Acid Alcohol 1% 10 giây
14 Potassium 5 phút
15 Eosin 3 phút
16 Nước máy 1 phút
17 Cồn 65% 1 phút
18 Cồn 90% 1 phút
19 Cồn 95% 1 phút
20 Cồn 100% 1 phút
21 Cồn 100% 1 phút
22 Cồn 100% 1 phút
23 Xylen 5 phút
24 Xylen 5 phút
25 Xylen 5 phút
Cho phiến kính có chứa mẫu vào trong giá và cho vào các khay nhuộm với thứ tự và thời gian như trên.
Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào sẽ bắt màu xanh dương. Vùng tế bào với lưới nội chất (tế bào gan, tuyến tụy ngoại tiết) có màu xanh nhạt hay tím. Phần tế bào chất còn lại sẽ dao động quanh màu hồng sậm.
Sử dụng keo Canada balsam để dán tiêu bản vĩnh viễn. Nhỏ một giọt keo lên trên lame, dán “lamella” lên trên ngay vùng có miếng mô. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô,
Footer Page 27 of 126.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
21
vì nếu trong lame có bọt khí thì khi quan sát dưới kính hiển vi gây khó khăn trong việc quan sát.