2.1. Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 5 giống cúc: chi đỏ, đỏ cờ, kim cương, thạch bích và vàng hè do phòng sinh lý thực vật, khoa Sinh – KTNN, Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2015 tại phòng Sinh lý thực vật của trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.3.1. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng trong các thí nghiệm: Cân kĩ thuật (Hãng GM612, Đức), tủ lạnh sâu (Hãng FRIGO), máy đo pH (Hãng HM30G/TOA, Đức), nồi hấp khử trùng (Hãng HV – 110/ HIRAYAMA, Nhật), tủ lạnh Hitachi (Hãng 31AG5D, Thái Lan), máy cất nước hai lần (Trung Quốc), Buồng cấy vô trùng (Hãng AV- 110/TELSTAR), máy khuấy từ nhiệt (Hãng ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Hãng Sartorius, Đức), tủ ấm (Hãng UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức).
2.3.2. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, panh cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, bình xịt cồn,…
2.4. Môi trường nuôi cấy
Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có bổ sung saccarozơ, agar, và các chất điều hoà sinh trưởng.
pH môi trường: 5,8
Môi trường nuôi cấy được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oC, 1atm trong 15 phút.
2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo: Ánh sáng: 3000 lux, quang kì: 16 giờ/ ngày, nhiệt độ phòng: 25oC - 27oC, độ ẩm trung bình:
70 - 74%.
2.6. Phương pháp nghiên cứu 2.6.1. Chuẩn bị vật liệu thực vật
Ngoài tủ cấy vô trùng: Thu mẫu ngoài tự nhiên là các chồi đỉnh. Cắt, rửa sạch dưới vòi nước chảy, lắc xà phòng, sau đó rửa sạch bằng nước cất và đem vào tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng: Lắc mẫu bằng nước cất khử trùng 3 - 4 lần. Sau đó lắc mẫu trong etanol 70% trong 5 phút và rửa lại bằng nước cất khử trùng 3 - 4 lần.
2.6.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu/TN.
*Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu
Mẫu tự nhiên sau khi thu về, cắt mẫu là đốt thân dài 3 - 4cm, rửa xà phòng dưới vòi nước chảy, sau đó rửa lại nước sạch 2 - 3 lần.
Tiếp đó đưa mẫu vào tủ cấy, tiến hành khử trùng làm sạch mẫu cấy.
Trước hết khử trùng sơ bộ qua cồn (70% (v/v)/5 phút) rồi rửa nước cất 2 - 3 lần, rửa mẫu bằng Javen (từ 5 - 15%/5 - 15 phút tương ứng với các công thức:
T1: Javel 5%/5 phút; T2: Javel 5%/10 phút; T3: Javel 10%/ 10 phút; T4: Javel 10%/ 15 phút và T5: Javel 15%/10 phút) rồi rửa lại nước cất 4 - 5 lần, thấm khô, đưa mẫu vào cấy.
Mẫu được cấy trên môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 30g saccarozơ/l, 7 g agar/l, pH = 5,8.
Các thí nghiệm làm tương tự lần lượt với các giống hoa cúc nhằm tìm ra công thức tối ưu để tạo vật liều khởi đầu cho từng giống cúc. Mẫu sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ cắt thành từng đoạn 1 cm, sau đó được cấy vào môi trường MS cơ bản, đặt lên giàn cấy và theo dõi tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch, tỉ lệ mẫu sạch nhưng chết trong 1 tuần.
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)
Tỉ lệ mẫu sạch sống (%)
Tỉ lệ mẫu sạch chết (%)
*Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng tái sinh chồi in vitro của các giống hoa cúc.
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS có bổ sung 30g saccarozơ/l, 7 g agar/l, pH = 5,8 và bổ sung BAP 0,7 mg/l (theo La Việt Hồng và cs, 2014) [3]. Sau 6 tuần theo dõi, tiến hành đo các chỉ tiêu: số chồi/ mẫu, số lá/chồi, chiều cao chồi (cm).
*Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy đến quá trình nhân nhanh chồi cúc.
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS có bổ sung 30g saccarozơ/ l, 7 g agar/l, pH =5,8 và BAP 0,7 mg/l. Các mẫu đỉnh sinh trưởng của mỗi giống được cắt chia làm 3 nhóm chiều cao: 1 cm, 2 cm, 3 cm. Theo dõi số lượng chồi được tạo ra trong 6 tuần của từng nhóm.
Số mẫu bị nhiễm Tổng số mẫu cấy
x 100
=
Tổng số mẫu sạch Tổng số mẫu cấy
x 100
=
Tổng số mẫu sạch nhưng chết Tổng số mẫu cấy
x 100
=
*Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phương thức cấy mẫu đến sự phát triển chồi mới phát sinh
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS có bổ sung 30g saccarozơ/ l, 7 g agar/l, pH =5,8 và BAP 0,7 mg/l.
Từ kết quả của Thí nghiệm 3, các mẫu đỉnh sinh trưởng (được cắt theo chiều cao thuộc nhóm cho hệ số nhân chồi cao nhất) của mỗi giống được cấy thành 2 nhóm phương thức: thẳng đứng, nằm ngang. Theo dõi chiều cao chồi của mỗi nhóm trong 6 tuần.
2.6.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được phân tích thống kê theo các tham số: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn,… Sự sai khác giữa các giá trị trung bình được kiểm tra bằng phương pháp giới hạn sai khác nhỏ nhất trên chương trình Excel 2010 [6].