VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6 Phương pháp nghiên cứu
3.6.1 Phương phỏp ủỏnh giỏ tớnh an toàn của vacxin
ðể ủỏnh giỏ tớnh an toàn của vacxin PRRS sử dụng phương phỏp tiờm ủồng loạt cho lợn mọi lứa tuổi trừ lợn nỏi mang thai. Sau tiờm sẽ theo dừi 1 tuần về biến ủổi cục bộ và thõn nhiệt của cơ thể, ăn uống, ủi lại, sống, chết…
3.6.2 Phương phỏp ủỏnh giỏ hiệu lực của vacxin 3.6.2.1 Bố trí thí nghiệm
Sử dụng 12 lợn 3 tuần tuổi của trại ông Nguyễn Quý Tâm, xã Tân Hội, Huyện ðan Phượng- Hà Tõy (cũ) ủó ủược tiờm và chưa ủược tiờm vacxin phũng PRRS ủể cụng cường ủộc. Thớ nghiệm ủược bố trớ như sau:
Lịch tiêm vacxin Nhóm lợn Lợn số
Liều tiêm Tuổi lợn Vị trí tiêm ðược tiêm một mũi
vacxin 1, 2, 3, 4, 5 ðược tiêm hai mũi
vacxin 10, 11, 12
2 ml/mũi 3 tuần Bắp thịt sau gốc tai ðối chứng 6, 7, 8, 9 Không tiêm vacxin
Tiêm vacxin mũi hai sau mũi một 28 ngày.
Sau khi tiờm vacxin hoàn tất, chỳng tụi tiến hành bắt 12 lợn ủó chọn về trung tâm Chẩn đốn thú y TW chuẩn bị cơng cường độc.
Lợn thí nghiệm được đưa về trung tâm Chẩn đốn thú y TW, được nuơi thớch nghi trong 3 ngày trước khi cụng cường ủộc. Mỗi lợn ủược tiờm 1ml huyễn dịch chứa 106 TCID50 PRRSV chủng cường ủộc ủược phõn lập tại Việt Nam năm 2007 mang mã số là 07196. Thời gian theo dõi lợn sau khi công cường ủộc là 21 ngày.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33
3.6.2.2 Chỉ tiờu ủỏnh giỏ
Chỉ tiêu Thời gian theo dõi
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng - Hàng ngày (cả sáng và chiều)
- Kiểm tra nhiệt ủộ - Hàng ngày (ủo vào buổi sỏng từ 7-9 giờ) - Lấy mỏu ủếm bạch cầu
- Lấy máu kiểm tra kháng thể
- Ngày 0, 4, 7, 10, 14, 21 sau công cường ủộc
- Ngày 0, 4, 7, 14, 21 sau cụng cường ủộc - Lấy máu kiểm tra virus huyết
- Mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm xỏc ủịnh PRRSV.
- Khi lợn chết hoặc khi kết thúc thí nghiệm mà lợn không chết.
3.6.3 Phương pháp tiến hành 3.6.3.1 Phương phỏp ủếm bạch cầu
Bạch cầu là những tế bào máu có vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cơ thể nhờ chức năng thực bào và chức năng miễn dịch. Do ủú sự biến ủộng số lượng bạch cầu của lợn thí nghiệm là một chỉ tiêu quan trọng.
* Nguyên liệu cần sử dụng là:
- Acid acetic 1% (1ml acid acetic trong 99 ml nước khử ion). Sau khi pha bảo quản ở nhiệt ủộ phũng.
- Chất chống ủụng EDTA.
- Buồng ủếm Newbauer.
- Kính hiển vi
* Các bước chuẩn bị:
+ Lấy mỏu cho vào ống efpendof cú chứa chất chống ủụng EDTA.
+ Trộn ủều mẫu mỏu bằng mỏy vortex.
+ Cho 100 àl mỏu vào ống efpendof cú chứa 900 ul acid acetic.
+ Trộn ủều hỗn hợp bằng mỏy vortex.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………34
* Cỏch ủếm bạch cầu:
+ Trộn ủều hỗn hợp trong ống efpendof một lần nữa
+ ðặt lamen lờn buồng ủếm Newbauer nhỏ mẫu mỏu vào buồng ủếm sao cho mẫu vừa lỏng ủều trờn buồng ủếm.
+ ðếm bạch cầu ở 4 ô vuông lớn ở 4 góc rồi lấy trung bình Công thức tính
Số lượng bạch cầu/àl mỏu = Số bạch cầu ủếm ủược x 100/1àl mỏu ðơn vị àl mỏu tương ủương với mm3 mỏu.
3.6.3.2 Phương pháp ELISA gián tiếp
ELISA là một trong những phương phỏp quan trọng ủể xỏc ủịnh khỏng thể PRRS trong huyết thanh. ELISA có nhiều loại trực tiếp, gián tiếp, trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng ELISA giỏn tiếp ủể phỏt hiện khỏng thể PRRS trong huyết thanh của 12 lợn thí nghiệm.
a. Nguyên lý chung
Thực chất của phản ứng ELISA sử dụng kháng thể hoặc kháng kháng thể có gắn enzyme cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên. Sau ủú cho cơ chất vào. Nếu khỏng thể tương ứng với khỏng nguyờn thỡ khỏng thể hay kháng kháng thể có gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng cơ chất tạo lờn màu. Khi so màu bằng quang phổ kế sẽ ủịnh lượng ủược mức ủộ của phản ứng.
b. Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng Bộ kít INDEXX Herd Check gồm:
- ðĩa nhựa 96 giếng - ðối chứng dương, âm
- Nước rửa (washing concentrate) 10X. Khi rửa phải pha nước rửa thành nồng ủộ 1X (1/10 nước rửa 10X và 9/10 nước cất).
- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent)..
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………35
- Antiporcine HRPO conjugate- kháng kháng thể có gắn enzyme.
- TMB (3, 3, 5, ,5 tetra methyl benzidine) substrate - hỗn hợp chất phát màu và cơ chất của phản ứng ELISA.
- Dung dịch dừng phản ứng (Stop solution).
Mẫu huyết thanh cần chẩn đốn.
Dụng cụ phũng thớ nghiệm bao gồm: mỏng ủể ủổ nguyờn liệu, pipet ủơn, ủa kờnh, mỏy ủọc ELISA...
c. Cách tiến hành
* Chuẩn bị
+ Chuẩn bị mẫu huyết thanh bằng cách pha loãng huyết thanh cần kiểm tra ở nồng ủộ 1/40 (10 àl huyết thanh + 390 àl PBS).
+ Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng: Trước khi làm phản ứng, lấy nguyờn liệu ra ủể ở nhiệt ủộ phũng từ 5- 10 phỳt.
+ Chuẩn bị ủĩa phản ứng.
* Các bước tiến hành
- Bước 1: Nhỏ ủối chứng dương và õm theo ủỳng sơ ủồ ủĩa ELISA (trang 38), với lượng 100 àl.
- Bước 2: Nhỏ mẫu huyết thanh ủó chuẩn bị vào vị trớ từ 1 ủến 46 theo theo ủỳng sơ ủồ trang 38. Mỗi giếng nhỏ lượng 100 àl.
- Bước 3: Ủ 30 phỳt ở nhiệt ủộ phũng.
- Bước 4: Rửa ủĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 àl dung dịch rửa.
- Bước 5: Nhỏ 100 àl conjugate vào tất cả cỏc giếng - Bước 6: Ủ ở nhiệt ủộ phũng trong 30 phỳt.
- Bước 6: Rửa ủĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 àl dung dịch rửa.
- Bước 7: Nhỏ 100 àl TMB
- Bước 8: Ủ ở nhiệt ủộ phũng 15 phỳt.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36
- Bước 9: Nhỏ 100 àl dung dịch dừng phản ứng.
- Bước 10: ðọc kết quả ở bước súng 650 nm, nhờ mỏy ủọc ELISA Labsystems multiskan MS.
- Bước 11: Tính kết quả dựa vào công thức
OD mẫu PRRS – OD mẫu NHC
S/P =
OD pos PRRS – OD pos NHC
* Lưu ý:
Kết quả ELISA chớnh xỏc cần thoả món cỏc ủiều kiện sau:
+ PC (PRRS) – NC (PRRS) ≥ 0,15 + PC (NHC) ≤ 0,12
+ NC (NHC) ≤ 0,25
Sơ ủồ ủĩa ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC A
ðC + ðC+ 7 7 B
ðC - ðC - C
1 1
D
2 2
E
3 3
F
4 4
G
5 5
H
6 6 46 46
3.6.3.3 Phương pháp IPMA
IPMA sử dụng ủể phỏt hiện khỏng thể nghi hoặc khỏng nguyờn nghi.
Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng IPMA ủể phỏt hiện khỏng thể nghi.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………37
* Nguyên lý:
Thực chất của phản ứng này là kháng nguyên kết hợp với kháng thể giống như phương pháp ELISA.
* Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng a. Thiết bị:
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp ủộ 2 - Kớnh hiển vi ủảo chiều.
- Máy hút chân không, máy li tâm lạnh, máy khuấy từ và que khuấy từ - Cõn ủiện tử chớnh xỏc ủến 4 ủơn vị.
- Tủ lạnh, tủ mát, tủ ấm thường, tủ ấm CO2, tủ sấy - Nồi ủun cỏch thuỷ, nồi hấp
- Một số thiết bị khỏc ủể bảo quản và nuụi cấy tế bào.
b. Dụng cụ
- Chai thuỷ tinh, cốc thuỷ tinh các kích cỡ 100, 200, 500, 1000 ml - Pipet thuỷ tinh 1,5 và 10 ml
- Micropipet ủơn, Micropipet nhiều ủầu
- Dụng cụ nuụi cấy tế bào chai nhựa Flask T75, ủĩa nhựa 96, 24, 6 giếng.
- Ống Falcon ủỏy vỏt.
c. Hoá chất
- Môi trường EMEM với 5% FCS (Fetal calf serum - huyết thanh thai bê) - Dung dịch A: Dung dịch cố ủịnh tế bào, gồm: PBS cú 10% Formalin và 1% NP40.
- Dung dịch B: Dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1% Tween 80
- Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS 1% Tween 80 và 5% sữa gầy
- Dung dịch E: Dung dịch AEC, gồm 1ml AEC + 14 ml Acetate buffer 0, 1 M (PH 5,2 ) + 15 àl H202 30%.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38
d. Môi trường tế bào MARC 145
e. Giống virus cường ủộc kớ hiệu PRRS NCVD – 07196, phõn lập từ mẫu phủ tạng lợn của Bắc Giang nhiễm PRRS năm 2007.
* Cách tiến hành
* Bước 1: Chuẩn bị tế bào MARC -145 vào ủĩa 96 giếng.
+ Sau khi ống tế bào MARC- 145 ủựng trong cryotube ủược ủưa ra khỏi bỡnh nitơ lỏng, nhanh chúng ủược giải ủụng rồi cho vào ống Falcon 15 cú chứa sẵn 10 ml dung dịch EMEM 5% FCS. Trộn ủều và ly tõm 1500 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Hỳt nước trong ở trờn bỏ ủi, cho tiếp vào 5ml dung dịch EMEM 5% FCS trộn ủều. Hỳt dung dịch này cho vào chai Flask T75. ðể vào tủ ấm CO2 khoảng 24 h ủưa ra quan sỏt dưới kớnh hiển vi ủảo chiều, xem sự phát triển của tế bào. Thay dung dịch phát triển 1 ngày 1 lần. Trong khoảng 2- 4 ngày sẽ thu ủược một thảm tế bào. Thường thu tế bào khi ủó phỏt triển chiếm hết 90% diện tích chai Flask.
+ Thu tế bào và chia ủều vào ủĩa 96 giếng. Mỗi giếng cho 100àl.
+ Ủ ủĩa tế bào trong tủ ấm 370C từ 1- 2 ngày cho tế bào trong giếng phỏt triển thành một lớp ở ủỏy giếng.
* Bước 2: Gây nhiễm PRRSV.
+ Lấy dung dịch virus từ nơi bảo quản, giải ủụng nhanh rồi ủem chuẩn ủộ, rồi pha loóng virus sao cho cú 500 TCID50 virus/ml.
+ Cho dung dịch virus ủó pha vào mỗi giếng với lượng 100 àl/giếng.
+ Ủ ủĩa trong tủ ấm CO2 trong 2 ngày.
* Bước 3: Cố ủịnh tế bào nhiễm.
+ ðổ dung dịch nuôi dưỡng
+ Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch A + Ủ ở nhiệt ủộ phũng khoảng 30 phỳt + Rửa ủĩa bằng dung dịch rửa B 2 lần.
* Bước 4: Cho kháng thể lần 1 là kháng thể cần kiểm tra
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………39
+ ðối với phản ứng chỉ ủịnh tớnh ủể biết õm hay dương chỉ cần pha loãng huyết thanh ở mức 1/160.
+ ðối với phản ứng ủịnh lượng pha theo cơ số 2 bắt ủầu từ 1/10.
+ Cho 50 àl huyết thanh cần kiểm tra vào cỏc giếng.
+ Ủ ủĩa ở 370C trong 30 phỳt.
+ Rửa ủĩa 3 lần bằng dung dịch B.
* Bước 5: Cho kháng thể lần 2- Kháng kháng thể có gắn enzyme peroxidase.
+ Pha loãng kháng thể lần 2 với dung dịch nước rửa theo tỷ lệ 1/600.
+ Cho vào mỗi giếng 50 àl khỏng thể lần 2 ủó pha loóng.
+ Ủ ở 370C trong 30 phút
+ Rửa ủĩa 3 lần bằng dung dịch rửa B
* Bước 6: Cho cơ chất:
+ Cho vào mỗi giếng 50 àl dung dịch AEC- dung dịch E + Ủ ở nhiệt ủộ phũng 30 phỳt
* Bước 7: ðọc kết qủa:
ðể ủọc kết quả sử dụng kớnh hiển vi ủảo chiều.
Giếng nào quan sỏt thấy thảm tế bào cú những ủỏm tế bào bắt màu ủỏ ủậm, thỡ mẫu huyết thanh cho vào giếng cú khỏng thể PRRS.
Giếng nào quan sát thấy toàn bộ thảm tế bào có màu hồng nhạt của dung dịch EMEM 5% FCS, thỡ mẫu huyết thanh cho vào giếng ủú khụng cú kháng thể PRRS.
3.6.3.4 Phương pháp realtime RT- PCR
ðõy là phương phỏp cú ủộ chớnh xỏc rất cao, dựng ủể phỏt hiện sự cú mặt của PRRSV trong huyễn dịch, huyết thanh và dịch nổi. Nú ủược ỏp dụng để xét nghiệm, chẩn đốn bệnh động vật thuộc Cục thý y.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………40
3.6.3.4.1 Máy móc, nguyên liệu Hệ thống chiết tách RNA Máy Realtime PRC
Bộ Micropipette các kích cỡ
Kít RT-PCR: Qiagen One-step RT-PCR Kit (Cat No.210210) Primer và Probe
Modification Tên Primer/Probe Sequence (5’-3’)
5’ 3’
Probe TGT GGT GAA TGG CAC
TGA TTG ACA FAM BHQ1
Forward ATG ATG TGC TGG CAT TCT None None PRRS-1
(NA)
Reverse ACA CGG TCG CCC TAA TTG None None 3.6.3.4.2 Cách tiến hành.
a. Chiết tách RNA.
+ Chuẩn bị dung dịch Buffer RTL, dung dịch này lấy ra từ bộ kit phải bổ sung thêm β- Mercaptoethanol theo tỷ lệ 1/100. Chuẩn bị sẵn ống 1,5 ml cú chứa 600 àl dung dịch RTL ở trờn.
+ Lắc ủều mẫu bằng mỏy Vortex trong 5 giõy, rồi ly tõm bằng mỏy Spindown ủể mẫu ở xung quanh xuống hết.
+ Chuyển vào ống 1,5 ml cú chứa dung dịch RTL ở trờn 200 àl (ủối với huyễn dịch tổ chức), 50 àl ủối với huyết thanh, viết ký hiệu mẫu vào thành ống.
+ Lắc ủều bằng mỏy Vortex trong 15 giõy, sau ủú ly tõm bằng mỏy spindown.
+ Cho vào 40 àl cồn Ethanol 100% (ETOH) tiến hành lắc và ly tõm.
+ Ly tâm 1000 vòng trong 1 phút
+ Cho dịch nổi của mẫu vào hệ thống cột RNeasy Qiagen, hút chân
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………41
không cho dịch nổi xuống hết.
+ Cho vào cột Rneasy Qiagen 700 àl nước rửa 1 (RW1) + Cho thờm 2 lần nước rửa 2 vào cột, mỗi lần 500 àl.
+ Chuyển cột vào ống thu mới.
+ Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút.
+ Cho vào ống 500 àl RNase- Free H2O chờ 1 phỳt.
+ Ly tõm 10.000 vũng trong 1 phỳt ủể thu RNA b. Chuẩn bị Master mix
Qiagen one-step RT-PCR kit
Reagent Lượng (àl)
DW (De ionized water) 10.5
5x Reaction Mix 5.0
MgCl2 (25mM) 1.2
dNTP 0.8
Primer and probe 1.5
Enzyme mix 1.0
Cho 20 àl master mix vào ống PRC.
Cho 5 àl mẫu RNA vào ống PRC.
ðặt ống PRC vào máy Realtime PCR machine.
Chạy chương trình.
Chọn ủọc màu ở bước kộo dài.
c. Chạy phản ứng.
Qiagen One-step RT-PCR kit
RT (reverse transcription) PCR (polymerase chain reaction) Nhiệt ủộ Thời gian Số chu kỳ Nhiệt ủộ Thời gian Số chu kỳ
500 C 30 phút 950 C 10 giây
950 C 15 phút 1
600 C 60 giây 40
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………42
3.6.3.4.3. ðọc kết quả.
Xột nghiệm ủược cụng nhận khi:
+ ðối chứng dương tớnh cho giỏ trị Ct ủó biết (± 2).
+ ðối chứng âm tính không có Ct.
+ Mẫu ủược coi là dương tớnh khi cú Ct ≤ 35.
+ Mẫu ủược coi là õm tớnh nếu khụng cú Ct.
+ Mẫu ủược coi là nghi ngờ nếu cú Ct > 35.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………43