3.1. Thời gian và địa điểm
Tiến hành thí nghiệm từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022, tại phòng thí nghiệm Viện Ứng dụng Công nghệ và Phát triển Bền vững— Trường Đại học Nguyễn Tat Thành.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Nguyên liệu
Mười mẫu mật ong có nguồn gốc khác nhau được mua từ các nhà cung câp khác nhau và tiễn hành nghiên cứu vào tháng 07 năm 2022. Thông tin về nguồn gốc của mẫu mật ong được trình bày trong Bảng 3.1. Sau khi thu thập, các mẫu mật ong được lưu trữ trong chai thủy tinh, sau đó tiến hành mã hóa mẫu và dán nhãn phân biệt. Mật được bao
quản trong các chai thủy tinh kín ở nơi khô ráo, thoáng mát với nhiệt độ từ 20 — 25°C
cho đến khi phân tích.
Mẫu đối chứng: Mật ong manuka New Zealand.
Bảng 3.1. Thông tin mẫu mật ong nghiên cứu
STT Thông tin mẫu Loài thực vật Vị trí Mã mẫu 1 Mậtong hoa nhãn Dimocarpus longan Bến Tre HNI(n=3) 2 _ Mậtong hoa cà phê Coffea arabica Dak Lak CF2 (n= 3) 3 Mat ong hoa vai Litchi chinensis Bac Giang HV3 (n= 3)
4 Mat ong hoa bạc ha Mentha arvensis L. Ha Giang BH4 (n= 3)
5 Mat ong hoa dừa Cocos nucifera L. Bén Tre HD5 (n= 3)
6 Mat ong lá cao su Hevea brasiliensis Gia Lai CS6 (n= 3) 7 Mậtong hoa tram Melaleuca Ca Mau HT7 (n= 3) 8 Mậtonghoachômchôm Nephelium lappaceum Déng Nai CC8 (n= 3)
9 Mậtong hoa st vet Rhizophora mangle Nam Dinh SV9 (n= 3) 10 Mat ong hoa keo Acacia Thai Nguyên HK10 (n=3) 11 Mat ong Manuka Leptospermum scoparium New Zealand Manuka
15
Vi khuẩn: Các chủng vi khuân được sử dung trong nghiên cứu được cung cấp từ phòng thí nghiệm Viện Ứng dụng Công nghệ và Phát triển Bén vững — Trường Đại học Nguyễn Tat Thành gồm: Gram âm: Escherichia coli NRRL B-409, Pseudomonas
aeruginosa NRRL B-14781, Salmonella typhimurium YS1646. Gram dương: Listeria monocytogenes NRRL B-2354, Staphylococcus aureus NRRL B-313. Cae chung vi
khuan được bảo quan từ 6 đến 8°C.
3.2.2. Dung cu thi nghiém
Dụng cu được sử dung trong nghiên cứu gồm: Đĩa peptri @ 9cm, bình trung tính schott 250 mL, ống nghiệm thủy tinh 25x150mm; cốc tủy tinh 250 mL, bình định mức 100 mL, ống đong 100 mL, pipette 10 mL, micropipette 1000-5000 uL, micropipette 100-1000 pL, cuvet, que cấy trang, dung cu đục lỗ tròn, dau túyp 100 — 1000 uL, đầu túyp 1000-5000 wL, eppendort 2mL, đèn côn.
3.2.3. Hóa chất sử dụng
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: Acid hydrochloric (HCI),
chloroform (CHC]:), acid acetic (CH3COOH), natri hydroxide (NaOH), acetate chì (Pb (CH:COO;};), acetone (C3H6O), potassium iodide (KD, iod (2), ethanol (C2HsOH), Potassium Persulphate (KzSzO;), acid ascobic (CứHsOs) được mua từ cụng ty Xilong
(Trung Quốc); 2,2-Diphenyl-l-pierylhydrazyl (DPPH), 2,2’ Azino-bis-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) được mua từ công ty Toronto Research 16
Chemicals (Canada); môi trường MHA (Mueller-Hinton Agar), resaunn MHB
(Mueller-Hinton Broth), BHI (Brain Heart Infusion) được mua từ công ty Himedia (An
độ).
3.3. Bồ trí thí nghiệm
3.3.1. Phan tích thành phan hóa thực vật
Mục tiêu: Định tính thành phần hóa thực vật trong một số sản phâm mật ong trên
thị tường Việt Nam.
Yếu tố cố định: 10 mẫu mật ong đã được trình bay trong Bang 3.1.
Yếu tố thay đối: Các thành phan định tính gồm phenolic, alkaloids, steroids,
flavonoids, tannins, saponins.
Bồ trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí gồm 11 mẫu mật ong với 3 lần lặp lại:
Tổng số nghiệm thức: 33 nghiệm thức
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 11 x 3 lần lặp = 33 đơn vị thí nghiệm
Bang 3.2. Bảng bố trí thí nghiệm định tính các thành phan hoá thực vật
Các chỉ tiêu định tính
Phenolic Alkaloids Steroids Flavonoids Tannins Saponins Mat ong
HN1 CP2 HV3 BH4 HDS CS6 HT7 CC8 Sv9 HK10 Manuka
3.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa
Khả năng bắt gốc tự do DPPH
Mục tiêu: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của một số sản phẩm mật ong trên thị trường Việt Nam bằng khả năng bắt gốc tự do DPPH
Yếu tố có định: Tỉ lệ thuốc thử DPPH
17
Yếu tố thay đồi: 10 mẫu mật ong đã được trình bay trong Bảng 3.1.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí 11 mẫu mật ong với 3 lần lặp lại:
Tổng số nghiệm thức: 33 nghiệm thức
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 11 x 3 lần lặp = 33 đơn vị thí nghiệm Khả năng bắt gốc tự do ABTS
Mục tiêu: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của một số sản phẩm mật ong trên thị trường Việt Nam bằng khả năng bắt gốc tự do ABTS.
Yếu tổ có định: Tỉ lệ thuốc thử ABTS
Yếu tố thay đổi: 10 mẫu mật ong đã được trình bay trong Bảng 3.1.
Bồ trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí 11 mẫu mật ong với 3 lần lặp lại:
Tổng số nghiệm thức: 33 nghiệm thức
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 11 x 3 lần lặp = 33 đơn vị thí nghiệm
Bảng 3.3. Bảng bố trí thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá
Mật ong ICso DPPH ICso ABTS HN1
CP2 HV3 BH4 HDS CS6 HT7 CC8 Sv9 HK10 Man uka Vitamin C
3.3.3.
trường
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Mục tiêu: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số sản phẩm mật ong trên thi Việt Nam dựa trên hai phép thử gồm: Phương pháp khuếch tán giếng thạch với chỉ tiêu đường kính vòng tròn kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC — Minimum
Inhibitory Concentration) được xác định dựa trên sự đôi mau cua chat chi thị resazurin.
18
Yếu tố thay đối: 10 mẫu mật ong đã được trình bay trong Bảng 3.1.
Mẫu mật ong đối chứng: Mật ong manuka New Zealand Bồ trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí 11 mẫu mật ong với 3 lần lặp lại:
Tổng số nghiệm thức: 33 nghiệm thức
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 11 x 3 lần lặp = 33 đơn vị thí nghiệm
Bang 3.4. Bảng bố trí thí nghiệm xác định đường kính vòng tròn kháng khuẩn Đường kính vùng ức chế vi khuẩn (mm)
Mật ong Gram âm Gram dương
E. coli P. aeruginosa S. typhimurium L. monocytogenes S. aureus HN1
CP2 HV3 BH4 HDS CS6 HT7 CC8 Sv9 HK10 M DC (+) DC (-)
Bang 3.5. Bang bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nồng độ ức chế tối thiểu % (w/v)
Mật ong Gram 4m Gram dương
E. coli P. aeruginosa S. typhimurium L. monocytogenes S. aureus HN1
CP2 HV3 BH4 HDS CS6 HT7 CC8 Sv9 HK10 M
19
3.4. Phương pháp phân tích
3.4.1. Phương pháp phân tích thành phan hoá thực vật
Cách tiến hành và chỉ tiêu đánh giá: Định tính các thành phần hoá thực vật trong mật ong được tham chiếu theo Saxene và cộng sự (2012) [18], cu thé các chỉ tiêu được thực hiện gồm:
Phenolic: Pha 1g mật ong với 2 mL nước cất, sau đó thêm vài giọt dung dịch FeCl; 1%. Xuất hiện màu xanh đậm cho thay sự hiện diện của các hợp chat phenolic.
Alkaloids: Pha 1g mật ong với 2 mL nước cat, sau đó hút thêm vào 1 ml HCI 1%
và 1 ml thuốc thử Wagner. Xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ cho thấy sự hiện diện của
alkaloids trong mật ong.
Steroids: Pha 1g mật ong với 2 mL nước cất, sau đó thêm vào 1 mL CHC]; và 1 mL H;SO¿, lắc đều hỗn hợp và dé yên một thời gian, màu đỏ xuất hiện ở lớp dưới cho thấy sự hiện diện của steroids trong mật ong.
Flavonoids: Pha 1g mật ong với 2 mL nước cat, sau đó thêm vào 5 giọt dung dịch NaOH 1%. Hỗn hợp xuất hiện màu vàng đậm, sau đó thêm 1 mL HCI 1%. Dung dịch không màu được hình thành cho thấy sự hiện diện của flavonoids trong mật ong.
Tannins: Pha 1g mật ong với 2 mL nước cắt, sau đó thêm vào ba giọt acetate chì 1%. Kết tủa được hình thành, cho thấy sự hiện diện của tannins trong mật ong.
Saponins: Pha 1g mật ong với 2 mL nước cat, hỗn hợp được lắc mạnh. Sự hình thành bọt cho thấy sự có hiện diện của saponins.
3.4.2. Phuong pháp đánh giá hoạt tinh kháng oxy hoá
Khả năng bắt gốc tự do DPPH
Nguyên lý: Khi DPPH phản ứng với một hợp chất chống oxy hóa, đặc tính gốc tự do của nó bị mat và màu chuyên từ tim sang vàng và có thé theo dõi sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 517nm [48].
Cách tiến hành:
Phương pháp phân tích sử dụng thuốc thử DPPH được tham chiếu theo Tri Nhut
Pham và cộng sự (2022) [49].
Pha dung dịch DPPH (stock solution): Cân 0,012g DPPH chuẩn pha với dung môi (ethanol tinh khiết) định mức đến 50ml. Dung dich làm việc (DPPH working
20
solution) được chuẩn bị bằng cách pha loãng DPPH stock solution với dung môi (ethanol) đến độ hap thụ từ 1,08 — 1,12 ở bước sóng 517 nm.
Pha loãng mật ong đến khoảng nồng độ phù hợp thu được dịch mẫu, hút dịch mẫu và ethanol vào ống nghiệm theo tỉ lệ Bảng 3.2. Sau đó, dung dịch DPPH làm việc (working solution) gồm 750 uL được hút vào ống nghiệm, lắc đều và dé 6n định ở bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, mẫu được đo độ hấp thụ quang học ở 517 nm trên máy quang phố UV-VIS (Thermo Scientific, Evolution 60S, Trung Quốc). Mẫu đối chứng thay mật ong bang ethanol. Vitamin C (acid ascorbic) với nồng độ l; 2; 3; 4;
5 mg/mL được sử dụng làm chất chuẩn dé so sánh.
Bảng 3.6. Tỉ lệ mẫu và thuốc thử đo DPPH
Số ống A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dich mau(pL) 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Ethanol(uL) 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0
Thuốc thir
DPPH (uL)
750 750 750 750 750 750 750 750 750 750 750
Chi tiêu và phương pháp đánh giá:
Với sự hiện điện của chất chống oxy hóa, màu tím của DPPH bị phân hủy và có thé theo đối sự thay đổi độ hap thụ ở bước sóng 517nm. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH
(IC %) được xác định dựa theo công thức:
Abse — Absr
IC (%) = “ng. 100
Cc
Trong do:
e Absc: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng e Absr: Độ hap thụ quang của mẫu thử
Giá trị ICso giá trị mà tại đó phần trăm ức chế DPPH của mẫu thử đạt 50%. Giá trị này được tính dựa trên phương trình đường chuẩn của phần trăm ức chế và nồng độ mẫu thử.
Khả năng bắt gốc tự do ABTS
Nguyên lý:
21
ABTS+ [2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] là một gốc tự do bền phát huỳnh quang màu xanh có bước sóng hấp thu đặc trưng là 734 nm. Khi một chất chống oxy hóa được thêm vào, ABTS* mat màu xanh lam sang màu vàng. Mic độ làm giảm cường độ hấp thu ở 734 nmm nói lên khả năng chống oxy hoá của chất thử
nghiệm [48].
Cách tiến hành:
Phương pháp phân tích sử dụng thuốc thử ABTS được tham chiếu theo
Moniruzzaman và cộng sự (2012) [39].
Chuan bị 10ml ABTS 7,4 mM: Hòa tan 0,038g ABTS chuẩn trong 10ml nước cất (dung dịch A).
Chuan bi 10ml K;SzO; 2,6 mM: Hòa tan 0,007g KzSzO; với 10ml nước cất (dung
dich B).
Pha dung dich ABTS (stock solution): Tron một lượng bang nhau các dung dịch A và B và dé trong bóng tối, trong ngăn mát tủ lạnh, trong thời gian 12 - 16 giờ trước khi sử dụng. Dung địch làm việc (ABTS working solution) được chuẩn bị bằng cách pha loãng ABTS (stock solution) với dung môi (nước cat) đến độ hap thụ từ 1,08 — 1,12
ở bước sóng 734 nm.
Pha loãng mật ong đến khoảng nồng độ phù hợp thu được dịch mẫu, hút dịch mau và ethanol vào ống nghiệm theo tỉ lệ bảng 3.16. Sau đó, hút 750 wL dung dịch ABTS đã pha loãng vào ống nghiệm và đề trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau đó đo độ hấp thụ quang học ở 734 nm trên máy quang phổ UV-VIS (Thermo Scientific, Evolution 60S, Trung Quốc). Mẫu đối chứng thay mật ong bang nước cat.
Vitamin C (acid ascorbic) được sử dụng làm chất chuẩn dé so sánh.
Bảng 3.7. Tỉ lệ mẫu và thuốc thử đo ABTS
Số ống A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Mẫu (uL) 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 Ethanol (uL) 250 225 200 175 +4150 125 100 75 50 25 0
Thuốc thir
ABTS (wL)
750 750 750 750 750 750 750 750 750 750 750
22
Chỉ tiêu và phương pháp đánh giá: Với sự hiện diện của chất chống oxy hóa, màu xanh của ABTS bị phân hủy và có thé theo dõi sự thay đôi độ hap thụ ở bước sóng 734 nm. Hoạt tính khử gốc tự do ABTS (IC %) được xác định dựa theo công thức:
Abs; — Abs
IC (%) = — 100
(64
Trong đó:
e Absc: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng e Absr: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Giá trị ICso giá trị mà tại đó phần trăm ức chế DPPH của mẫu thử đạt 50%. Giá trị này được tính dựa trên phương trình đường chuẩn của phần trăm ức chế và nồng độ mẫu thử.
3.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Chỉ tiêu đánh giá: Đường kính vòng tron kháng khuẩn, nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC).
Phương pháp đánh giá: Hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu mật ong được đánh giá dựa trên hai phép thử gồm:
Phương pháp khuếch tán giếng thạch dựa vào chỉ tiêu đường kính vòng tròn kháng khuẩn được tiến hành theo mô tả của Balouiri và cộng sự (2016) [19].
Nông độ ức chế tối thiểu (MIC — Minimum Inhibitory Concentration) được xác định dựa trên sự đổi màu của chất chi thị resazurin, được tham chiếu theo Satyajit D.
Sarker và cộng sự [20].
Cách tiến hành:
Hoạt hoá vi khuẩn
Tất cả dụng cụ thí nghiệm và môi trường nuôi cấy được chuẩn bị và được hấp bằng nồi hấp tiệt trùng (Tomy, SS-325, Nhật Bản), ở 121°C trong 20 phút.
Huyền phù vi khuẩn: Các chủng vi khuan (Pseudomonas aeruginosa NRRL B-
14781, Salmonella typhimurium YS1646, Staphylococcus aureus NRRL B-313,
Escherichia coli NRRL B-409, Listeria monocytogenes NRRL B-2354) được nuôi cấy
động trong 10 mL môi trường Brain Heart Infusion (BHD) trong thời gian 36 gid ở nhiệt
23
độ 37°C bằng máy lắc kỹ thuật số (Jeio Tech, IST-4075, Hàn Quốc). Sau đó, dịch huyền phù được hiệu chỉnh bằng nước muối sinh ly NaCl 0,9% dén giá tri Mc Farland 0,5 tương đương 1 —2 x 108 CFU/mL.
Xác định đường kinh kháng khuẩn
Xác định đường kính vòng tròn kháng khuẩn được tiến hành: Pha loãng mật ong với nồng độ 90% (w/v) bằng nước cat.
Tiến hành trải đĩa: 100 uL dịch canh khuẩn nồng độ 108 CFU/mL được bơm vào đĩa thạch Mueller-Hinton Agar (MHA) và được trải đều lên bề mặt thạch bang que cay trang. Sau đó, thạch được đục lỗ giếng có đường kính là 6 mm. Tiếp theo mẫu đã pha loãng được nhỏ 100 wL vào trong mỗi giếng. Sau đó các đĩa được ủ ở 37°C trong 24 giờ trong tủ 4m (Faithful, DH500011, Trung Quốc). Đường kính kháng khuẩn được đo bằng thước đo điện tử (Digital Vernier Caliper, Trung Quốc), thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Gentamicin nồng độ 50 ug/mL được sử dụng làm đối chứng dương và nước cat làm đối chứng âm. Quy trình phân tích được thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2 (Topair,
My).
Xác định nông độ ức chế toi thiểu (MIC)
Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa hỗn hợp gồm 200
uL môi trường Mueller Hinton Broth (MHB) vô trùng, 200 uL mật ong đã được pha
loãng ở các nồng độ 90%; 45%; 22,5%; 11,25%; 5,62%; 2,8%; 1,4%; 0,7%; 0,35%;
0,17% (w/v) và 20 pL dich vi khuẩn với mật độ 10! CFU/mL. Giêng đối chứng đương chứa hỗn hợp 100 uL môi trường MHB, 100 uL Gentamicin (50 g/mL) và 20 uL dich vi khuẩn. Đối chứng âm chứa 100 uL môi trường MHB, 100 L nước muối 0,9% vo trùng và 20 wL dịch vi khuẩn. Thể tích cuối cùng ở mỗi giếng là 220 pL. Quy trình được thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2 (Topair, Mỹ).
Đĩa thí nghiệm được ủ ở 37 °C trong 24 giờ trong tủ 4m (Faithful, DH500011, Trung Quốc), sau đó thêm vào 20 uL thuốc thử resazurin 0,04% vào mỗi giếng. Sau 10 phút quan sát các giếng có sự đổi màu của dung dịch resazurin từ màu xanh sang màu hồng cho thấy sự tăng trưởng của vi khuẩn trong giếng. Nồng độ MIC được xác định tại nồng độ không làm đổi màu thuốc thử resazurin. Day là nồng độ thấp nhất trong dãy
nông độ thử nghiệm của mật ong có thê ức chê sự tăng trưởng của vi khuan.
24
3.4.4. Phương pháp xử lý thống kê
Các kết quả được trình bày dưới dạng số liệu trung bình + độ lệch chuẩn. Các số liệu ghi nhận trong từng thí nghiệm được tính toán và vẽ đồ thị bằng Excel 2019 của hãng Microsoft. Các phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) và khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (LSD) đã được thực hiện bang phần mềm Statgraphics Centurion XV_I của
hãng StatPoint tai p < 0,05.
25
CHƯƠNG 4