3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2022 đến tháng 11/2022 tại Viện Ứng dụng Công nghệ và Phát trién Bén vững thuộc trường Dai học Nguyễn Tat Thành Thành phố Hồ Chí Minh, khu Công Nghệ Cao, Thành phó Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Nguyên liệu
10 mẫu mật ong khác nhau về nguồn gốc thực vật đang phô biến trên thị trường được
chọn đê tiên hành nghiên cứu này. Thông tin vê nguôn gôc hoa và địa lý của các mâu mật
ong được liệt kê trong bảng 3.1. Mật ong Manuka được sử dụng làm tiêu chuẩn dé so sánh.
Bảng 3.1. Các mẫu mật ong nghiên cứu
STT Thông tin mẫu Loài thực vật Vị trí Mã mẫu
1 Mật ong hoa nhãn Dimocarpus longan Bén Tre HNI 2 Mật ong hoa cà phê Coffea arabica Buôn Ma Thuột CT2
3 Mật ong hoa vải Litchi chinensis Bac Giang HV3
4 Mat ong hoa bac ha Mentha arvensis L. Ha Giang BH4
5 Mật ong hoa dừa Cocos nucifera L. Bén Tre HD5
6 Mat ong 1a cao su Hevea brasiliensis Gia Lai CS6 7 Mat ong hoa tram Melaleuca Ca Mau HT7
8 Mat ong hoa chôm chôm Ne?helium lappaceum Đồng Nai ccs
9 Mật ong hoa sú vẹt Rhizophora mangle Nam Dinh SV9 10 Mậtong hoa keo Acacia Thai Nguyén HK10 11 Mat ong Manuka Leptospermum scoparium New Zealand Manuka
16
3.2.2. Hóa chất
Hóa chất dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Danh sách hóa chất dùng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất CTHH Độ tinh khiết Xuất xứ
1 Natribisulft NaHSO3 > 58,5% Trung Quộc 2 Acetate trihydrate Pb(CH3COO)2.3H20 99,5% Trung Quoc 3. Hydrochloric acid HCl 38% Trung Quôc Copper (II) sulfate 6 k 4 pentahydeate CuSO4.5H20 99% Trung Quôc
Disodium hydrogen i k 5 phosphate duđeoslryđode Na2HPO4.12H20 99% Trung iil 6 Sodium hydroxide NaOH 96% Trung Quôc Potassium sodium ử F 7 bulinde beắndtoriuf CuH¿OsKNa.4H:O 99% Trung lu 8 _ Iron(1IH) sulfate Fe2(SO4)3 23% Trung Quoc 9 Kalipemanganat KMnO¿ 99% Trung Quoc 10 Acid gallic C7H6Os > 99% Trung Quoc I1 Methanol CH:OH Trung Quộc 12 Folin- Ciocalteu FCR 99% Trung Quôc 13 Sodium carbonate Na2CO3 > 99,8% Trung Quoc 14 Nhôm clorua AlCl; > 97% Trung Quoc 15 Kali acetat CH:COOK 99% Trung Quôc
3.2.3. Thiết bị
Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Danh sách thiết bị sử dụng trong nghiên cứu STT Tên thiết bị Xuất xứ
1 Cân phân tích 4 số Ohaus PIONEER PA214 Mỹ 2 Lò nung Scifinetech Hàn Quốc 3. Máy đo quang phô UV — Vis — Thermo Trung Quốc 4 Bể điều nhiệt LK-LAB Hàn Quốc 5 Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ` 6 Tủ sấy âm Memmert D39263/D39264 Đức 7 Bình hút 4m Onelab Trung Quốc 8 Khúc xạ kế ATAGO PR - 101Alpha Nhật Bản 9_ Máy chuẩn độ điện thé Mehtrom EcoTitrator Thụy Sĩ
10 Máy đo mau Chroma CR-400 Konica Minolta Nhat Ban II Máy do hoạt độ nước Novasina LabTouch — aw Thuy Si
17
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp phân tích hóa lý
Các phương pháp phân tích hóa lý được thực hiện dựa trên hướng dẫn của AOAC (2000) và được điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Trong đó:
Độ 4m được xác định bằng cách say 5 g mỗi mẫu mật ong ở 105 °C cho đến khi ghi nhận kết quả khối lượng không đổi.
Độ acid tự do được xác định bằng phương pháp chuẩn độ thông qua thiết bị chuẩn độ điện thế Mehtrom EcoTitrator (Thuy Si).
Độ brix được do bằng khúc xa kế. Nhỏ vài giọt mật ong vào lăng kính khúc xạ của thiết bị và sau đó ghi nhận giá trị hiển thị trên màn hình.
Hoạt độ nước được xác định bằng máy đo hoạt độ nước Novasina Labtouch — aw.
Tro được xác định bằng cách cân 2 g mẫu mật ong vào cốc nung va đem nung trong lò nung với 600°C trong ít nhất 1 giờ. Làm nguội cốc nung trong bình hút 4m và cân. Tiến hành nung tiếp tục cho đến khi đạt được khối lượng không đổi. Hàm lượng tro của mẫu thử, W, biểu thị bằng gam trên 100g (g/100g), tinh theo công thức sau:
†n+ — TT
tự = a PHỦ „dan
Thọ Trong đó:
- mo là khối lượng của mẫu thử (g);
- mị là khối lượng của cốc nung và thử sau khi tro hóa (g);
- mạ là khối lượng của cốc nung (g).
Hydroxymethylfurfural (HMF) được xác định bang cách đo độ hấp thu của hỗn hợp mật ong đã pha loãng ở bước sóng 284 và 336 nm với dung dịch đối chứng là dung dịch NaHSO: 0,2%. Độ hap thu phải nhỏ hon 0.6, nếu lớn hon thì phải pha loãng bang
dung dịch NaHSO: 0,2%. Sau đó, HMF được tính theo công thức:
=) _ (ODzg4 — OD336) X 149,7 x 5 XD
HMF fe = W
18
Trong đó:
- D là độ pha loãng mẫu;
- W là khối lượng mẫu;
- ODzs¿ và ODass là độ hấp thụ đo ở bước sóng 284 và 336 nm;
- 5 là khối lượng mẫu;
126 1000 1000 x x 16830 10 50
126 là khối lượng phân tử HMF (g/mol);
16830 là hệ số hap thu phân tử (1/mol.em);
1000 là hệ số quy đổi miligam ra gam;
10 là hệ số quy đôi mililit ra lít trong phép thử;
1000 là hệ số quy đồi gam ra kilogam.
Hàm lượng đường tổng được xác định theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5266:1990 về Sản phẩm ong — Phương pháp xác định hàm lượng đường khử tự do [35].
Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm (glucose, fructose, maltose) có thé dé dang khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit có màu đỏ gach, qua đó tính được lượng
đường khử.
Cách tiến hành: Cân 2,5 g mật ong pha loãng với 125 ml nước cất rồi đun ở nhiệt độ 80 °C trong 15 phút, sau đó dé nguội ở nhiệt độ phòng. Thêm 10 ml Pb(CH:COO); 10%
vào hỗn hợp, lắc đều sau đó dé lắng, sau đó thêm tiếp 5 ml Na;HPO¿ để loại chì dư, dé lắng và đem lọc với giấy lọc. Thu dịch lọc và định mức lên 500 ml bằng nước cất, lắc đều. Sau đó hút 100 ml dich lọc cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 15 ml HCl 33% và đậy nắp,
dem đi đun cách thủy ở nhiệt độ 100 °C trong 15 phút, dé nguội. Hỗn hop được trung hòa bang NaOH 30% sau đó định mức lên 250 ml bằng nước cất. Hút 10 ml vào bình tam giác
250 ml, thêm 25 ml pheling A và 25 ml pheling B, đem đi dun cách thủy 5 phút ở 100 °C.
Sau khi làm nguội, thu được kết tủa đồng oxit (mau đỏ), loc và rửa bang nước cat. Kết tủa được hòa tan trong 10 ml Fez(SO¿): 5%. Sau đó, hỗn hợp này được chuẩn độ bằng dung
19
dịch KMnO¿ 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong I phút. Ghi nhận thể tích dung dịch KMnO, và tính hàm lượng đường tổng.
Tính toán kết quả: Hàm lượng đường tổng của mật ong (X) được xác định bằng:
500 _ 250
x=
$y, nẻo”
Trong do:
- X là ham lượng đường tổng (%);
- Vị là thé tích dung dịch được hút từ bình định mức 500 ml;
- V; là thé tích dung dịch được hút từ bình định mức 250 ml;
- Miu là khối lượng mẫu cân ban đầu (mg);
- mạ là khối lượng glucose (mg), khối lượng glucose được xác dinh dựa vào thé
tích dung dịch KMnÒ¿ được trình bày ở Phụ lục B.
3.3.2. Phương pháp phân tích hóa thực vật
Hàm lượng phenolic tông được xác định theo Lim và cộng sự (2007) [36].
Nguyên tắc: Thuốc thử Folin — Ciocalteu (Folin — Ciocalteu reagent — FCR) chứa hỗn hợp phosphotungstate và phosphomylybdate (màu vàng). Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenol tạo thành sản phẩm có màu xanh dương hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm. Hàm lượng hợp chất phenol tong số ti lệ thuận với cường độ màu, được biểu diễn bang phan trăm đương lượng acid gallic (GAE: acid gallic equivalent) có trong mẫu khô.
Tiến hành do: Trong một ống nghiệm, lắc đều hỗn hợp gồm 0,3 ml dịch trích, 1,5 ml Folin — Ciocalteu 10%. Mẫu được dé yên trong 5 phút, điều kiện chan sáng. Sau đó thêm 1,2 ml NazCO: 7,5% được thêm vào hỗn hợp và lắc đều. Sau 30 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng 29 — 31 °C, điều kiện chắn sáng, mẫu được phân tích mật độ quang ở bước
sóng 765 nm.
Tính toán kết quả: Hàm lượng phenolic tổng (TPC) của mẫu được thể hiện là mg đương lượng acid gallic/ 100 g vật chất khô:
(y—b)xV x đƒ x100 TPC GAE = `(mg /9) a x m(100% — 4m%) x 1000
20
Trong đó:
- y là giá trị OD của mẫu phân tích;
- a và b là hệ số trong phương trình đường chuẩn acid gallic (10 — 70 ug/ml);
- V là thé tích dịch trích ly;
- df là độ pha loãng;
- m là khối lượng của mẫu;
- 100/1000 là hệ số chuyền đổi từ ug/g sang mg/100g.
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp đo nhiệt lượng sử
dụng nhôm clorua [37].
Nguyên tắc: Phương pháp được Lamaison và Carnet đề xuất vào năm 1990, sử dụng AICI; làm thuốc thử. AICl: sẽ kết hợp với các nhóm ceto 6 Cy và các nhóm hydroxyl ở Ca, Cs của các flavone và flavonols tạo phức bền trong môi trường acid tạo thành màu vàng tươi, bền; có cực đại hấp thu trong khoảng 400 — 450 nm, và bước sóng 415 nm được chọn
cho phương pháp.
Tiến hành do: Tiên hành pha loãng dung dịch với nồng độ phù hợp (dich thu được ở phan chiết mau). Hút 0,5ml dung dịch mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm, sau đó thêm vào 0,1 ml dung dich AIC]; 10%. Tiép tục thêm vào 0,1 ml dung dịch CH;COOK 1M và 4,3ml nước cat, lac đều. Dé dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó đo độ hap thu quang học ở bước sóng 4l5nm trên máy quang phô UV-Vis. Quercetin được dùng làm chất chuẩn.
Tính toán kết qua: Hàm lượng flavonoid tổng (P) được biéu diễn theo mg duong luong quercetin trong 1 mg cao chiét (mgQE/mg cao chiét).
_C,xnxV x 100
~ mx (100—X) x 1073
Trong do:
- Cx là nồng độ quercetin xác định từ đường chuẩn (ug/ml);
- n là độ pha loãng từ dịch chiết gốc;
- V là thể tích dịch chiết gốc (ml);
- X là độ âm mẫu (%);
- m là khối lượng mẫu (g).
21
3.3.3. Đánh giá đặc điểm cảm quan, màu sắc của các mẫu mật ong
Phương pháp thử cảm quan mật ong được thực hiện theo quy định của tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5262:1990 về sản pham ong — phương pháp thử cảm quan [38].
Xác định mùi: Rot 50 ml mật ong mẫu vào cốc thủy tinh sạch, khô, dung tích 250
ml, thêm 50 ml nước cất 4m, khuấy đều và ngui trực tiếp 3 lần, mỗi lần cách nhau 1 phút dé xác định mùi của mật ong tự nhiên theo từng loại hoa và lá.
Xác định vị: Rot mật ong mẫu ra cốc, dùng thìa trộn đều, lây khoảng 1 — 2 ml, nếm
và nhận xét.
Xác định trạng thái: Rót mật ong mẫu vào thìa rồi nghiêng thìa cho mật ong chảy.
Quan sát tốc độ chảy, độ bám dính vao thìa, trạng thái đồng nhất của mật ong và nhận xét.
Cường độ màu được xác định theo Femeira và cộng su (2009) va Lacerda và cộng
sự (2010). Các mẫu mật ong được pha loãng với 50% nước cất rồi tiến hành đo cường độ màu bằng máy đo quang phổ UV-Vis tại 635 nm [39], [40]. Cường độ màu được xác định bằng thang Pfund theo phương trình sau:
Pfund = - 38,70 + 371,39 x Abs
Trong đó: Abs là độ hap thụ quang A (Absorbance).
22
Thang màu Pfund được phân loại theo bảng dưới đây:
Bảng 3.4. Thang màu Pfund
Thang màu Pfund (mm) Màu
Trắng trong