GIẢI ĐOÁN CẤU TRÚC CÁC SAPONIN TRONG BA CÂY P. BALFOURIANA, P. GUILGOYLEI VÀ P. SERRATA
Qua nghiên cứu tài liệu tham khảo và phân tích phổ NMR của các hợp chất hữu cơ cô lập từ ba loài P. balfouriana, P. guilfoylei, P. serrata cho thấy đa số các hợp chất hữu cơ hiện diện trong ba loài khảo sát là những saponin với phần aglycon là acid oleanolic. Tại C3 của acid oleanolic thường có gắn đường acid glucuronic và đường này có thể gắn thêm từ một đến ba phân tử đường khác tại C2’, C3’ và C4’
của nó. Các đường thường gặp là galactose, glucose, arabinose, xylose và rhamnose. Tại C28 của acid oleanolic cũng có thể gắn đường và chỉ thấy gắn một
N O
OH
HO OH O
H 1'
3' 5'
6' 6
14' 16'
1
3 5 6
7 10
O 8
HO
OH HO
OH
3'' 1'' 5'' 6''
18
(2S,3S,4R,2'R,8Z)-1-O--D-Glucopyranosyl-2-(2-6
hydroxyhexadecanoylamino)octadeca- 8-en-1,3,4-triol
(P. ser r at a)
N O
OH
HO OH O
H 1'
3' 5'
6' 7
14' 16'
1
3 5 6
7 8 10
HO O
OH HO
OH
3'' 1'' 5'' 6''
6 18
(2S,3S,4R,2'R,8E)-1-O--D-Glucopyranosyl-2-(2- hydroxyhexadecanoylamino)octadeca-
8-en-1,3,4-triol (P . f ulva)
đường glucose; riêng ở loài Polyscias fruticosa (L.) Harms. [56] có thấy tại C28 gắn đường glucose và C3’ của đường glucose này có gắn thêm một đường rhamnose.
Phổ NMR của những saponin này có những đặc trưng riêng, chúng tôi xin đúc kết những kết quả sử dụng phổ NMR và LC-MS để giải đoán cấu trúc các saponin trong các cây P. balfouriana, P. guilfoylei và P. serrata.
3.4.1. Về phổ 1H-NMR
Trên phổ đồ 1H-NMR của những saponin trong các loài Polyscias thường xuất hiện một số mũi cộng hưởng đặc trưng như: proton olefin H12 (δppm = 5,4; brs);
H3, H18 hiện diện dưới dạng mũi đôi-đôi trong vùng δppm = 2,5-3,5; các proton anomer của phân tử đường acid glucuronic gắn vào C3 của acid oleanolic hiện diện mũi đôi ở δppm = 4,7-4,9. Một số proton anomer có thể bị che khuất trong mũi cộng hưởng của nước. Các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng khác được trình bày trong bảng 3.27.
3.4.2 Về phổ 13C-NMR
Phổ 13C-NMR của các saponin này có cặp mũi cộng hưởng đặc trưng của nối đôi C=C (C12-C13) ở δppm = 145,5 và 122,5. Carbon C3 của acid oleanolic cộng hưởng ở δCppm = 78 và khi có gắn đường thì sẽ cộng hưởng ở δCppm = 89. Khi phân tử đường acid glucuronic gắn thêm phân tử đường khác ở C2’, C3’ hoặc C4’
thì những carbon này có độ dịch chuyển hóa học đặc trưng khác. Những vùng tín hiệu đặc trưng được trình bày trong bảng 3.28.
3.4.3. Về phổ LC-MS
Phổ LC-MS của các saponin có thể ghi nhận tín hiệu ion âm hoặc dương. Các mũi ion giả phân tử và mảnh ion thường gặp được trình bày trong bảng 3.29.
Bảng 3.27. Tổng kết các giá trị δH (pyridin-d5) của các saponin với aglycon là acid oleanolic trong chi Polyscias
Vùng dịch chuyển hóa học Đặc trưng của từng loại proton (δ ppm)
٭ 0,5-2,5 7 mũi đơn mạnh của 7 nhóm metyl tứ cấp với độ dịch chuyển hóa học là 1,13 (H27); 0,98 (H25); 0,92 (H30); 0,91 (H29); 0,90 (H23); 0,77 (H26) và 0,75 (H24).
Trong vùng này có thể có mũi đôi tại δ = 1,75 ppm (J = 6,3 Hz) là H6’ của đường rhamnose [39].
٭ 2,5–3,5 Mũi đôi-đôi, δ = 3,23 ppm (J = 11,5/4,0 Hz) là H3 (>CH–OH).
Mũi đôi-đôi, δ = 2,83 ppm (J = 13,7/4,0 Hz) là H18 (>CH–).
٭ 3,5–4,7 Tín hiệu cộng hưởng của các proton >CH–OH của đường.
H4’Glc: đôi-đôi (J # 8-9 Hz); H4’Gal: đôi-đôi (J # 1-4 Hz).
H4’Xyl: đôi-đôi-đôi (J # 5-7, 2-4 Hz); H4’Ara: đôi-đôi-đôi (J # 2-4 Hz).
H5’a Xyl: đôi-đôi (J # 5-7, 12 Hz); H5’a Ara: đôi-đôi (J # 2-4, 12 Hz).
٭ 4,7–5,9 Mũi đơn rộng ở δ = 5,3–5,4 ppm: proton olefin ở C12
Các mũi đôi (J # 7 Hz): proton anomer của các phân tử đường gắn vào aglycon tại C3.
٭ 6,0-7,0 Mũi đôi (J# 8 Hz): proton anomer của các phân tử đường gắn vào aglycon tại C28.
Proton anomer của đường rhamnose thường nằm ở vùng này dưới dạng mũi đơn hoặc đôi có J # 1-1,5 Hz.
٭ 10-14 Thường không có tín hiệu, nhưng nếu yêu cầu rõ thì xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton –COOH, dưới dạng mũi bầu thấp.
14 12 10 8 6 4 2 0
ppm
Vùng dịch chuyển hóa học Đặc trưng cho từng loại carbon (δ ppm)
٭ 10-56 Khung oleanan có 30 carbon, trong số đó có 26 carbon cộng hưởng ở vùng này: 15,3 (–CH3, C25); 15,6 (–CH3, C24); 16,8 (–CH3, C26); 18,3 (–CH2–, C6); 23,1 (–CH2–, C11); 23,4 (–CH2–, C16); 23,6 (–CH3, C30);
26,1 (-CH3, C27); 27,4 (–CH2–, C2); 27,7 (–CH2–, C15); 28,1 (–CH3, C23); 30,6 (–C–, C20); 32,5 (–CH2–, C22); 32,8 (–CH2–, C7); 33,1 (–CH3, C29); 33,9 (–CH2–, C21); 37,1 (–C–, C10); 38,5 (–CH2–, C1); 38,7 (–C–, C4); 39,3 (–C–, C8); 41,2 (>CH–, C18); 41,8 (–C–, C14); 46,0 (–CH2–, C19); 46,5 (–C–, C17); 47,7 (>CH–, C9); 55,0 (>CH-, C5).
Nếu xuất hiện thêm một mũi có δ ppm # 16-18: đó là mũi cộng hưởng của –CH3 của đường rhamnose.
Nếu xuất hiện thêm mũi khác nữa có δ # 52 ppm: là mũi cộng hưởng của –COOCH3 ở vị trí C28 của khung oleanan hoặc của –COOCH3 của đường acid glucuronic ở dạng glucuronat metyl.
٭ 62-63,5 Vùng cộng hưởng của –CH2-OH của C6’ của đường glucose hoặc galactose.
٭ 64-68 Nếu thấy tín hiệu ở δC # 66-67 ppm, đó là -O-CH2 của C5 của đường arabinose hoặc xylose.
٭ 78-81,7 C2’ của đường acid glucuronic có gắn thêm một phân tử đường khác.
٭ 82-84 C4’ của đường acid glucuronic có gắn thêm một phân tử đường khác.
٭ 84,5-87,9 C3’ của đường acid glucuronic có gắn thêm một phân tử đường khác.
٭ 88-90 Carbon C3 của acid oleanolic có gắn đường.
٭ 95-96 Cho biết C28 của acid oleanolic không ở dạng –COOH tự do mà ở dạng –COO-đường. Đây là carbon C1 của đường gắn tại C28.
٭ 100-107 Carbon anomer của các đường. Số carbon trong vùng này cho biết số phân tử đường hiện diện trong hợp chất.
٭120-150 Vùng tín hiệu đặc trưng của carbon olefin >C=CH- tại C12-C13 (δC12 = 122,5; δC13 =144,5)
٭170-182 Mũi cộng hưởng của –COOH hoặc –COOR.
–COOH (C28) : 180-181 –COOCH3 (C28) : 178-178,5 –COO–đường (C28) : 176 (có khi 179) –COOH (acid glucuronic) : 176-169,6
0 10 50
60 80
100 120
140 150 160 180
200
57 90
ppm
Bảng 3.28. Tổng kết các giá trị δC (pyridine-d5) của các saponin với phần aglycon là acid oleanolic
Bảng 3.30. Đúc kết những kết quả sử dụng phổ NMR và LC-MS để giải đoán cấu trúc các saponin trong ba loài P. balfouriana, P. guilfoylei, P. serrata - Mũi ion giả phân tử (ghi nhận ion dương hoặc âm) ở:
٭ m/z = 955 [acid oleanolic+ GlA+ 2Glc (hoặc Gal) –H]-: ứng với acid oleanolic có gắn 3 phân tử đường: một phân tử đường acid glucuronic và 2 phân tử đường glucose (hoặc galactose).
٭ m/z = 925 [acid oleanolic+ GlA+ Glc (hoặc Gal)+Ara (hoặc Xyl) –H]-: ứng với acid oleanolic có gắn 3 phân tử đường: một phân tử đường acid glucuronic, một phân tử đường glucose (hoặc galactose) và một phân tử đường arabinose (hoặc xylose).
٭ m/z = 793 [acid oleanolic+ GlA+ Glc (hoặc Gal) –H]-: ứng với acid oleanolic có gắn 2 phân tử đường: một phân tử đường acid glucuronic và 1 phân tử đường glucose (hoặc galactose).
- Mảnh ion ở:
٭ m/z = 631 Tương ứng với: [acid oleanolic + acid glucuronic –H]-
٭ m/z = 455 Tương ứng với phần aglycon là acid oleanolic: [acid oleanolic –H]-
٭ m/z = 439 Tương ứng với: [acid oleanolic –H2O+H]+
Nhìn vào phổ 13C và DEPT-NMR có thể nhận ra khung acid oleanolic qua các mũi cộng hưởng ở δC12 = 122,5 và δC13 =144,5; δC28 = 178-181 và δC6’ (acid glucuronic) = 172- 176. Carbon C3 có gắn đường với δC3 = 89. Số phân tử đường trong hợp chất dựa vào số carbon anomer trong vùng 95-110 ppm. Nếu có carbon anomer xuất hiện ở δC # 95-96 ppm thì trong hợp chất có đường gắn qua C28 của acid oleanolic. Nhìn vào vùng 78,7- 87,9 để dự đoán các phân tử đường gắn qua C2’, C3’ hoặc C4’ của acid glucuronic (bảng 3.28). Nhìn vào vùng 62-67,5 để dự đoán sự hiện diện của đường glucose (hoặc galactose), arabinose (hoặc xylose) (bảng 3.28).
Sau đó nhìn vào phổ 1H-NMR để xác định lại sự hiện diện của acid oleanolic qua các mũi ở δH12 = 5,4 (br s), δH3,18 = 2,5-3,5 (dd, hai mũi dd này nằm gần nhau), 7 mũi đơn trong vùng δH = 0,5-2,5 (bảng 3.27); phân biệt các loại đường qua tín hiệu proton anomer trong vùng 4,5-7,0 (d) và các proton >CH-OH ở vùng 3,5-4,7 (bảng 3.27).
Nhìn vào phổ LC-MS để xác định lại hợp chất có bao nhiêu phân tử đường, và đó là đường glucose (hoặc galactose), arabinose (hoặc xylose), rhamnose. Có thể dựa vào các mảnh ion để dự đoán phân tử đường nào nằm ở ngoài cùng (trong sự phân mảnh, phân tử đường nằm ngoài cùng dễ bị cắt đứt).
Nhìn vào phổ COSY, HSQC để xác định vị trí các phân tử đường gắn vào nhau và gắn vào acid oleanolic. Phổ HMBC chỉ ra sự tương quan của các proton và carbon, sẽ giúp kiểm tra lại cấu trúc của hợp chất.