3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh đầu đen do H. meleagridis gây nên ở gà nuôi tại huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang
3.4.1.1. Phương pháp điều tra công tác phòng chống dịch bệnh cho gà nuôi tại huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang
Để xác định được chính xác tình hình phân bố của Histomonas meleagridis tại địa phương chúng tôi tiến hành đồng thời hai phương pháp sau:
- Quan sát trực tiếp: đến địa bàn nghiên cứu, quan sát đàn gà và khu vực chăn nuôi gà.
- Phỏng vấn và phát phiếu điều tra các hộ gia đình để được thông tin cụ thể, chính xác.
3.4.1.2. Bố trí thu thập gà để mổ khám và phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm H. meleagridis ở gà nuôi tại huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang
a) Bố trí lấy mẫu
Bố trí thu thập gà mổ khám theo phương pháp lấy mẫu phân tầng.
Huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang: chọn 4 xã, mỗi xã mổ khám 75 gà.
* Bố trí lấy mẫu gà mổ khám theo các địa phương nghiên cứu
Chúng tôi mổ khám gà tại các địa phương cụ thể như sau:
Địa phương (xã)
Số gà mổ khám (con)
Quý Sơn 75
Trù Hựu 75
Nghĩa Hồ 75
Hồng Giang 75
Tổng 300
* Bố trí lấy mẫu gà mổ khám theo tuổi gà.
Chúng tôi thu thập gà để mổ khám theo các lứa tuổi gà như sau:
≤ 1 tháng
> 1 - 3 tháng
> 3 - 5 tháng
> 5 tháng
* Bố trí lấy mẫu gà mổ khám theo phương thức chăn nuôi
Chúng tôi tiến hành mổ khám gà theo các phương thức chăn nuôi sau:
chăn thả hoàn toàn, bán chăn thả, nuôi nhốt hoàn toàn tại huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang
* Bố trí lấy mẫu gà mổ khám theo tình trạng vệ sinh thú y (VSTY) Tình trạng VSTY được phân ra ba mức như sau:
- VSTY tốt: chuồng trại cao ráo, thoáng mát, sạch sẽ, thường xuyên quét dọn chuồng nuôi và khu vực xung quanh chuồng nuôi, thu gom phân và chất độn chuồng để ủ, định kỳ khử trùng, tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, phát quang cây cỏ, khơi thông cống rãnh.
- VSTY trung bình: không thường xuyên quét dọn chuồng nuôi và khu vực xung quanh chuồng nuôi, chuồng nuôi không được làm khô ráo, còn có những vũng nước đọng; không thường xuyên tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và phát quang cây cỏ; không thường xuyên khơi thông cống rãnh ở gần khu vực chăn nuôi.
- VSTY kém: chuồng gà làm ở chỗ đất trũng, trong chuồng và khu vực xung quanh chuồng rất ẩm thấp, có nhiều vũng nước đọng, có nhiều cỏ cây um tùm, không tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, không khơi thông cống rãnh.
Chúng tôi tiến hành mổ khám gà ở 3 tình trạng vệ sinh thú y trên.
* Bố trí lấy mẫu gà mổ khám theo kiểu nền chuồng nuôi
Chúng tôi tiến hành mổ khám gà nuôi trên các kiểu nền chuồng là: nền đất, nền lát gạch hoặc nền xi măng.
b) Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm H. meleagridis ở gà tại các địa phương Tỷ lệ nhiễm H. meleagridis ở gà được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp sau:
* Quan sát triệu chứng lâm sàng
* Mổ khám kiểm tra bệnh tích
* Soi tươi manh tràng
* Làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin manh tràng và gan.
Các phương pháp cụ thể như sau:
* Quan sát triệu chứng lâm sàng: triệu chứng toàn thân, mào tích, da vùng đầu và mép, phân (màu sắc và trạng thái phân).
* Mổ khám bệnh tích
Trước khi mổ khám, ghi nhật ký thí nghiệm các thông tin: chủ hộ, địa chỉ, ngày lấy mẫu, giống gà, tuổi gà, phương thức chăn nuôi, điều kiện vệ sinh thú y, kiểu nền chuồng, tính biệt, trạng thái và màu sắc phân, các biểu hiện lâm sàng khác (nếu có).
Phương pháp mổ khám gà: mổ khám gà theo phương pháp mổ khám toàn diện, quan sát bằng mắt thường và kính lúp các nội quan như thận, lách, tim, phổi, đặc biệt là gan và manh tràng để xác định những biến đổi đại thể, chụp ảnh vùng có bệnh tích điển hình.
* Phương pháp soi tươi manh tràng
Tiến hành mổ khám cơ quan tiêu hoá gà (Theo Trịnh Văn Thịnh 1963 [10];
Phạm Văn Khuê và cs 1996 [2]). Dùng dao mổ nạo nhẹ niêm mạc manh tràng, lấy một ít niêm mạc và chất chứa trong manh tràng (bằng hạt đỗ xanh) cho lên phiến kính đã có sẵn 1 giọt nước cất; dùng góc la men khuấy đều rồi đậy lamen lên để dàn thành một lớp mỏng; sau đó soi dưới kính hiển vi (10 x 20 hoặc 10 x 40) để phát hiện H. meleagridis qua sự di chuyển đơn bào nhờ sự vận động của roi.
* Phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin.
Các bước tiến hành:
+ Lấy mẫu bệnh phẩm (gan, manh tràng): cắt phần bệnh phẩm có nhiều tổn thương.
+ Cố định bệnh phẩm bằng dung dịch formol 5%.
+ Rửa nước 12 - 24 h (rửa dưới dòng nước chảy nhẹ) để trôi hết formol.
+ Khử nước: dùng cồn tuyệt đối để rút nước từ trong bệnh phẩm ra + Làm trong bệnh phẩm: ngâm bệnh phẩm qua hệ thống xylen để làm trong bệnh phẩm
+ Tẩm parafin: ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đựng paraffin nóng chảy, để ở tủ ấm nhiệt độ 500C.
+ Đổ Block: rót parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức (bệnh phẩm) đã tẩm parafin vào. Khi parafin đông đặc hoàn toàn thì bóc khuôn. Sửa lại Block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: cắt bệnh phẩm trên máy cắt Microcom, độ dày mảnh cắt khoảng 3 - 4àm. Dỏn mảnh cắt lờn phiến kớnh bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng 1 phần, glyxerin 1 phần; 1 ml hỗn hợp trên pha trong 19 ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin - Eosin
+ Gắn lamen bằng Baume canada, dán nhãn và đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 150 - 600 lần.
3.4.1.3. Phương pháp nghiên cứu sự liên quan giữa bệnh đầu đen và bệnh giun kim ở gà
* Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun kim gà qua mổ khám - Phương pháp mổ khám, thu thập giun kim
Mổ khám gà theo phương pháp mổ khám không toàn diện cơ quan tiêu hoá. Lấy toàn bộ chất chứa trong manh tràng và ruột già để xét nghiệm bằng phương pháp lắng cặn Benedek (1943), thu thập toàn bộ số giun kim có trong mỗi gà.
Những mẫu có giun kim được đánh giá là có nhiễm, ngược lại là không bị nhiễm.
- Phương pháp xác định cường độ nhiễm giun kim
Cường độ nhiễm được xác định bằng đếm số lượng giun kim ký sinh/gà:
≤ 100 giun kim/gà: nhiễm nhẹ
> 100 - 500 giun kim/gà: nhiễm trung bình
> 500 giun kim/gà: nhiễm nặng
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm H. meleagridis ở những gà nhiễm giun kim và gà không bị nhiễm giun kim
Kết hợp quan sát triệu chứng lâm sàng, soi tươi manh tràng, làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin manh tràng và gan của gà mổ khám (những gà này đã xác định được là nhiễm hoặc không nhiễm giun kim). Những gà có H. meleagridis được đánh giá là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
* Phương pháp nghiên cứu sự ô nhiễm trứng giun kim ở khu vực xung quanh chuồng nuôi, nền chuồng và vườn chăn thả gà.
- Phương pháp thu thập mẫu
+ Mẫu cặn nền chuồng: tại mỗi ô chuồng lấy mẫu cặn ở 4 góc và ở giữa ô chuồng, trộn đều được một mẫu xét nghiệm (khoảng 80 - 100 g/mẫu). Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon có ghi nhãn: tên chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu. Mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày.
+ Mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuôi: trong khoảng bán kính 5 m xung quanh chuồng gà, cứ 10 - 15m2 lấy một mẫu đất bề mặt. Một mẫu có khối lượng từ 80 - 100 g, được trộn đều bởi 4 mẫu ở 4 góc và 1 mẫu ở giữa.
Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon có ghi nhãn: tên chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu.
+ Mẫu đất ở vườn chăn thả gà: cứ 10 - 15m2 lấy một mẫu đất bề mặt.
Một mẫu có khối lượng từ 80 - 100 g, được phối hợp bởi 4 mẫu ở 4 góc và 1 mẫu ở giữa. Mỗi mẫu được để riêng trong túi nilon có ghi nhãn: tên chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu.
- Phương pháp xét nghiệm mẫu: áp dụng phương pháp Gefter để phát hiện trứng giun kim.
Phương pháp Gefter: là phương pháp được sử dụng để xét nghiệm trứng giun trong đất.
Cách làm: Cho NaOH 5% vào mẫu đất tỉ lệ (1,5 NaOH : 1 đất), đưa vào máy lắc 3 - 5 phút để tách trứng giun ra khỏi đất, sau đó đưa vào máy ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút 2 - 3 phút. Bỏ bớt phần nước phía trên, giữ phần cặn có trứng giun, cho dung dịch NaNO3 bão hòa vào, trứng giun kim có tỉ trọng nhỏ hơn sẽ nổi lên trên, dùng vòng thép vớt trứng hoặc dùng lam kính cho tiếp xúc với bề mặt của dung dịch ta sẽ thu được trứng giun.