CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105oC.
2.3.2 Phương pháp hóa học
2.3.2.1 Xác định thành phần protein
Xác định thành phần protein bằng phương pháp Kjeldahl [2].
Nguyên tắc :
- Đốt nóng mẫu cần phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa; carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O. Còn Nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3, kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
H-CH-COOH + H2SO4 NH3 + CO2 + H2O + SO2
NH2
NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
- Dùng kiềm mạnh NaOH để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do.
(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 H2O + 2 NH3
- NH3 sinh ra được chưng cất vào dung dịch axit boric có chứa chất chỉ thị methylene xanh và methyl đỏ.
2 NH4OH + H3BO3 (NH4)2B4O7 + 7 H2O - Định phân lượng (NH4)2B4O7 tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,01N.
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5 H2O (NH4)2SO4 + 4 H3BO3
Các bước tiến hành và tính toán kết quả được trình bày ở mục 1.1.3 phụ lục 1.
2.3.2.2 Xác định đường khử
Xác định đường tổng bằng phương pháp Bertrand [2].
- Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm các đường khử (glucose, fructose, maltose...) dễ dàng khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling. Kết tủa đồng I oxyt có màu đỏ gạch, có khả năng khử với muối Fe3+ thành muối Fe2+ trong môi trường axit:
CuSO4 + 2 NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
- Fe2+ sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO4 là chất oxy hóa nên dùng KMnO4 để chuẩn độ Fe2+ trong môi trường axit:
10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8 H2O - Dựa vào lượng KMnO4 sử dụng ta có thể tính được lượng Cu2O và từ đó tính được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường khử của Bertrand.
- Các bước tiến hành và tính toán được trình bày cụ thể ở phần 1.1.2 phụ lục 1.
2.3.2.3 Xác định thành phần Pectin
Trong môi trường kiềm, pectin hòa tan sẽ giải phóng ra nhóm methoxyl thành rượu methylic và axit pectin tự do..Định lượng axit pectic sinh ra bằng cách kết tủa với Ca2+ tạo canxi pectat. Rửa sạch, sấy khô và cân lượng tủa tạo thành từ đó tính ra hàm lượng axit pectic [5].
Cách tiến hành
- Cân khoảng 10g mẫu vào bình, cho thêm 100ml NaOH 0,1N. Để hỗn hợp qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin.
- Lọc hỗn hợp qua giấy lọc và thêm 50ml CH3COOH 1N vào dịch lọc.
- Sau 5 phút, thêm 50ml CaCl2 2N và giữ 1 giờ
- Đun sôi hỗn hợp trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc đã được sấy đến khối lượng không đổi (m1).
- Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng đến khi không còn ion Cl- (thử nước rửa bằng dung dịch AgCl 1% đến khi không có tủa trắng).
- Cho giấy lọc có kết tủa vào tủ sấy, sấy đến khối lượng không đổi và cân (m2).
Tính kết quả
Hàm lượng pectin trong mẫu được tính theo công thức:
Trong đó:
m: khối lượng mẫu phân tích (g) m1: khối lượng giấy lọc (g)
m2: khối lượng giấy lọc và tủa pectate canxi (g) 0,92: hệ số chuyển đổi từ canxi pectat về pectin 2.3.2.4 Xác định xơ (cenllulose)
Hàm lượng cenllulose được xác định bằng phương pháp thủy phân trong axit mạnh và kiềm mạnh [2].
Nguyên tắc
Sử dụng kiềm mạnh và axit mạnh để loại bỏ ligin, hemicenlulose thu hồi cenllulose. Kĩ thuật này không ảnh hưởng gì đến cenlulose ngay cả những phân tử lượng thấp.
2.3.3 Qui trình chiết pectin từ vỏ chuối
Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành chiết theo quy trình chuẩn có sửa đổi (Ranganna S, 2001), (Joye and Luzio, 2000) như hình 2.2.
Hàm lượng phần trăm pectin xác định theo công thức:
y (%) = 100 (P / B)
Trong đó:
- ypec = pectin chiết xuất được, tính bằng phần trăm (%), - P = Lượng pectin chiết xuất được, g
- Bi = Khối lượng mẫu ban đầu, g.
Hình 2.2 Sơ đồ chiết tách pectin Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu:
Vỏ chuối được nghiền mịn, sau đó trộn lẫn với dung môi theo tỷ lệ 1: 20, khuấy trộn để nguyên liệu phân tán đều trong dung môi. Ba loại dung môi sử dụng khảo sát trong nghiên cứu là nước, HCl và axit xitric.
Ngâm
Mục đích của ngâm giúp dung môi thẩm thấu vào nguyên liệu và bước đầu giải phóng các pectin tự do có trong nguyên liệu vào dung môi.
Lọc Chiết, trích li
Rửa bã
Nguyên liệu: dung môi Ngâm
Trung hòa (pH=4,5 Cô đặc
Rửa tủa Sấy Dịch lọc
Kết tủa, Lọc Cồn 96°
600C, 24h
Nghiền nhỏ Pectin thô
Cồn 96° ( 2:1)
600C, 24h KOH 0.1N Nhiệt độ, thời gian
Gia nhiệt, giữ nhiệt
Nhiệt độ cao làm tăng các phản ứng sinh hóa, cùng với tác dụng của axit sẽ cắt đứt các mạch protopectin thành pectin tự do và giải phóng vào dung môi. Qúa trình chiết cần đủ thời gian để chuyển hóa protopectin thành pectin.
Lọc, rửa bã
Là quá trình tách dung dịch chứa pectin ra khỏi bã nguyên liệu. Qúa trình rửa bã được tiến hành với nước cất mục đích thu hồi triệt để lượng pectin có trong nguyên liệu.
Cô đặc
Tiến hành cô đặc ở nhiệt độ 60oC trong 24h.
Qúa trình cô đặc loại bỏ nước tăng nồng độ chất khô giúp tạo điều kiện cho quá trình kết tủa.
Kết tủa, rửa tủa
Dùng cồn 96oC để kết tủa pectin trong dung dịch. Tỷ lệ cồn 2:1 so với thể tích dung dịch sau cô đặc.
Đây là quá trình tách pectin ra khỏi hỗn hợp. Qúa trình chuyển pectin từ dạng hòa tan sang dạng kết tủa bông xốp.
Lọc kết tủa ra khỏi dung dịch, tạo điều kiện cho quá trình sấy.
Qúa trình rửa tủa loại bỏ các tạp chất bám dính vào pectin.
Sấy
Sấy tủa ở nhiệt độ 60 oC, trong 24h.
Mục đích giảm lượng nước trong sản phẩm để tăng thời gian bảo quản của sản phẩm.
Nghiền, rây
Mục đích giảm kích thước bán thành phẩm và thu được pectin bột đồng nhất.
2.2.4 Khảo sát các điều kiện chiết pectin 2.4.1 Khảo sát lựa chọn dung môi
Tiến hành chiết pectin theo sơ đồ 2.1 lần lượt với các loại dung môi nước, axit HCl 0,1 N, axit xitric 5%. Các thông số của quy trình là: gia nhiệt lên 60oC, giữ nhiệt 1h .
2.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đơn biến đến quá trình chiết pectin a, Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Tiến hành chiết pectin theo quy trình 2.2 chiết ở nhiệt độ 60 oC,70 oC, 80 oC, 90
oC, và các thông số kĩ thuật khác được giữ nguyên theo quy trình.
b, Ảnh hưởng của thời gian
Tiến hành chiết pectin theo quy trình 2.2 chiết với thời gian 50, 60, 70, 80, 90 phút, các thông số kĩ thuật khác được giữ nguyên theo quy trình.
c, Ảnh hưởng của nồng độ dung môi
Tiến hành khảo sát nồng độ axit xitric tại các mức khảo sát 3%, 5%, 7%, 9%
theo qui trình 2.2. Các thông số kĩ thuật khác giữ nguyên.
2.2.5 Qui hoạch thực nghiệm và tìm kiếm tối ưu
Để nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến quá trình chiết pectin ta tiến hành quy hoạch trực giao cấp một ba yếu tố hai mức ảnh hưởng [6].
Qúa trình tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel.
2.2.6 Xác định pectin chiết tách bằng phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau. Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR hiện nay có thể mở rộng vùng bức xạ(100 cm-1 - 10000 cm-1 ). Trong lúc đó, vùng bức xạ của các nhóm cacbonhydrat trong khoảng 950 -1200. Chính vì vậy phổ hồng ngoại có khả năng hấp thụ các nhóm chức và xác định được mẫu pectin thử [29].
Nguyên tắc:
Khi ánh sáng hồng ngoại truyền qua, các nhóm nguyên tử hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối liên quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. Để xác định pectin ta sử dụng phương pháp so sánh phổ hồng ngoại của mẫu thử và mẫu chuẩn về vị trí và mức độ hấp thụ ở các bước sóng. Nếu có sự tương đồng ta có thể kết luận mẫu thử à pectin.
2.2.7 Xác định chỉ số DE bằng phương pháp chuẩn độ Nguyên tắc
Dựa vào sự thủy phân liên kết ester trong phân tử pectin trong môi trường kiềm.
Pectin dưới tác dụng của kiềm loãng sẽ giải phóng nhóm methoxyl dưới dạng rượu
methylic và axit pectic. Từ hàm lượng kiềm tiêu tốn trong phản ứng thủy phân có thể tính được chỉ số DE của pectin [19].
Kết quả: Chỉ số DE được xác định theo công thức DE = =
Trong đó:
V1 : Thể tích NaOH chuẩn độ lần 1 V2 : Thể tích NaOH chuẩn độ lần 2 Tiến hành
- Hòa tan 0,2 g pectin với 20 ml nước cất nóng 40°C trong bình nón 250ml, thêm 4 giọt phenolphthalein.
- Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Ghi lại thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ (V1)
- Thêm 10ml NaOH 0,1N vào bình nón, khuấy ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ.
- Sau đó thêm 10ml HCl 0,1 N để trung hòa NaOH, thêm 4 giọt phenolphthalein và chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Ghi lại thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ lần 2 (V2).
2.2.8 Tạo màng bằng hỗn hợp pectin, alginat
Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành thăm dò khả năng bảo quản của pectin thu được bằng cách tạo màng hỗn hợp với Alginat bảo quản quả mận.
Cách tiến hành
- Hòa tan riêng biệt pectin và alginate trong nước với nồng độ 3% . Để qua đêm ở nhiệt độ phòng cho dung dịch hòa tan triệt để.
- Tiến hành trộn hỗn hợp pectin alginat tại nhiệt độ 70oC có đánh khuấy để thu được hỗn hợp đồng nhất.
- Pha canxi clorua nồng độ 2%.
- Nhũng mận vào hỗn hợp tạo màng sau đó nhúng vào dung dịch CaCl2.
- Để khô màng ở nhệt độ phòng và thăm dò khả năng bảo quản.
Phương pháp tạo màng sử dụng trong nghiên cứu này là nhúng.