2.2.1. Phương pháp phan lập nam từ địa y
Mẫu địa y dùng để phân lập được thu và sử dụng trong vòng một tuần. Tuy nhiên, địa y có thể được bao quản ở trạng thái khô trong vai tuần hoặc dé tủ đông
trong vài năm [46].
Phương pháp thường dùng nhất để phân lập nam cộng sinh địa y (mycobiont) là phân lập từ các bào tử đơn. Đầu tiên, các mẫu địa y được rửa kĩ băng nước đề loại bỏ bụi ban và các mảnh vụn trên bê mặt bang cách cho mẫu địa y vào cốc có chứa nước cất và ngâm chúng trong khoảng | giờ hoặc rửa sạch chúng dưới voi nước chảy trong 15 phút. Tiếp theo, mẫu sẽ được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm lần lượt trong con 70° trong 90 giây và NaOCl 4% trong 5 phút. Sau đó, mẫu được rửa lại băng nước cat vô trùng. Mẫu địa y có thê được thâm khô bang giấy lọc vô trùng dé loại bỏ nước thừa hoặc đẻ khô tự nhiên trong tủ cấy [46].
Mẫu địa y được cắt mong bằng dao lam tiệt trùng va chuyên lên lam kính tiệt
trùng. Bào tử nam được quan sát ở độ phóng đại 40X và 100X. Sau đó. bào tử nam
được hút bằng micropipette và chuyên lên dia Petri chứa môi trường MYA có bô sung
10% đường sucrose. Cuối cùng, các đĩa này được bao gói và ủ trong tôi ở 18°C trong
1 thang [46].
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy nam cộng sinh địa y trên môi trường rắn và môi
trường lòng
Khi nuôi trên môi trường ran, nắm cộng sinh địa y được nuôi trong các đĩa Petri
hoặc bình tam giác chứa môi trường MYA, ở nhiệt độ từ 22 — 23°C, trong tối. Sinh khối nam và môi trường nuôi được thu vào các thời điểm 6 tuần, 8 tuần, 10 tuần, 12 tuần và 20 tuần.
Khi nuôi trên môi trường lỏng. nắm cộng sinh địa y được nuôi trong các đĩa Petri chứa môi trường MYA ở điều kiện nhiệt độ từ 22 — 23°C. Sau đó, các khối thạch chứa sinh khối nắm có đường kính 0,5 em được thu nhận bằng cách dùng khoan đục
lay lỗ thạch trên dia Petri nuôi nam. Mỗi khối thạch được chuyên vào một bình tam chứa sẵn 100 ml môi trường MY lỏng. Sau đó, các bình tam giác này được nuôi trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ khoảng 22 — 23°C trong 3 tháng. Sau 3 tháng, sinh khối nam được tách ra khỏi môi trường nuôi bằng cách lọc qua giấy lọc.
2.2.3. Phương pháp tạo các cao chiết
Sinh khối nam được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 45°C. Tiếp theo, sinh khối nắm được ngâm với một lượng dung môi ethyl acetate tương ứng. Các dich chiết được lọc bằng cách sử dụng giấy lọc Whatman và được cô đặc dưới áp suất thấp trong
máy cô quay.
Môi trường MYA (dạng rắn) sau khi nuôi nam cũng được ngâm với | lượng ethyl acetate tương đương. Sau đó, môi trường được loại bỏ băng cách lọc qua giấy lọc. Dịch chiết sau lọc được cô đặc dưới áp suất thấp trong may cô quay.
Môi trường MY lỏng sau khi nuôi nam được ngâm với | lượng ethyl acetate tương đương. Sau đó, cao ethyl acetate được tạo ra bằng phương pháp chiết lỏng —
lỏng và cô quay.
Riêng sinh khối nắm và môi trường nuôi nắm thu ở 20 tuần còn được chiết xuất bằng các dung môi methanol và acetone với phương pháp tương tự như phương pháp
21
tao cao ethyl acetate, cô quay. Cuối cùng, các cao chiết được dé bay hơi hoàn toàn ở
nhiệt độ phòng va thu được cao ethyl acetate, cao methanol khô và cao acetone thô.
Các cao thô này được sử dung cho thí nghiệm thử hoạt tính kháng oxi hoá.
2.2.4. Khao sát hoạt tinh kháng oxi hoá bằng phương pháp bay gốc tự do DPPH 2.2.4.1. Nguyên tắc
Phương pháp DPPH được giới thiệu lần đầu tiên bởi Marsden Blois vào năm 1958. DPPH (1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl) là gốc tự do én dinh, bên ở nhiệt độ thường, dạng bột màu đen ở điều kiện thường, có mau tím đặc trưng trong dung môi (thường ding methanol, ethanol). Gốc DPPH có bước sóng hap thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất chống oxi hoá (dung dịch DPPH từ màu đen tím chuyên sang màu vàng). Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ ban dé đánh giá hiệu quá hoạt động làm sạch gốc tự đo của các chất chống oxi hoá dựa trên sự thay đổi độ hap thu của dung dich DPPH ở 517 nm. Giá tri do mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ kha năng bay gốc tự do của mẫu thử càng cao [5].
2.2.4.2. Pha mẫu thử
Các mẫu thử được cân và pha loãng thành nông độ 1000 pg/ml như mô tả ở Bang 2.2.
Bang 2.2. Cách pha loãng các mẫu cao ethyl acetate thành nồng độ 1000 pg/ml
HƠI tir
Môiubg | 12 | 1A0
vã + res
Sinh khôi |
Moi ting |
minh khỏi |
~ | Môimờg | 93 | Cd
6 tuar
S tuar
22
Tương tự như vay, cao methanol và cao acetone chiết xuất từ môi trường nuôi và sinh khối nắm cộng sinh địa y thu ở 20 tuần cũng được pha loãng ở nồng độ 1.000
ug/ml (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Cách pha loãng mẫu cao methanol và cao acetone từ môi trường nuôi và
sinh khối nắm cộng sinh địa y Graphis sp. thu ở 20 tuần thành nồng độ 1.000 pg/ml Khối lượng cao mẫu | V Methanot pha toang
(mg) (ul)
3 chiết methano |
Bên cạnh đó, ean ethyl acetate chiết xuất từ môi trường nuôi nam cộng sinh địa
y phân lập được nuôi trong 20 tuần từ nồng độ 1.000 pg/ml tiếp tục được pha loãng thành các nồng độ khác nhau (500, 250, 125 và 62.5 ug/ml) trong phương pháp thử
nghiệm DPPH.
2.2.4.3. Tiến trình thí nghiệm khảo sát hoạt tinh kháng oxi hoá bằng phương pháp bay góc tự do DPPH
Mẫu thử được pha loãng thành các nồng độ khác nhau. Sau đó, 200 pl mẫu thử cho vào mỗi ống nghiệm, bỗ sung thêm | ml dung dịch DPPH ở nông độ 80 pM. Hon hợp được ủ ở 30 phút trong điều kiện không có ánh sáng ở nhiệt độ phòng. Sau đó,
hỗn hợp được do giá trị mật độ quang OD ở bước sóng 2.= 517 nm. Trong thí nghiệm
xác định khả năng bẫy gốc tự do DPPH, methanol được sử dụng lam chứng âm,
vitamin C (ascorbic acid) được sử dụng làm chứng đương. Hoạt tinh kháng oxi hoá
ở các nồng độ khác nhau sẽ được tính theo công thức.
Tỉ lệ loại gốc tự do DPPH (%) = (OD, - OD„)/OD. x 100%
Trong đó:
ODằ: giỏ trị mật độ quang của mẫu.
OD-: giá trị mật độ quang của chứng âm.
Đồ thị tương quan giữa ti lệ % kháng oxi hoá với nòng độ mẫu được xây dựng dựa trên tỉ lệ % kháng oxi hoá của 5 nồng độ mẫu liên tiếp. Giá trị ICso được xác định
đựa vào phương trình y = ax + b [2].
2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu
Các thí nghiệm trong đề tài được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý thống kê bằng phan mém Statgraphics Centurion XVI, kết quả được trình bày đưới dạng trung bình + độ lệch chuẩn. Đô thị được biêu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel 365.