3.2.1. Ảnh hướng của điều kiện nuôi tĩnh hoặc nuôi lắc đến hoạt tính
kháng oxi hoá
Nắm cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi cay trên môi trường MYA và MY lỏng ở nhiệt độ khoảng 22 — 23°C, sinh khôi nam được thu sau 3 tháng nuôi cay.
Bảng 3.1. Sinh khối nam thu được khi nuôi trên môi trường MYA và MY lỏng Môi trường nuôi cấy MY lỏng
Sinh khối nam (g) 14,37
Từ lượng giống ban đầu như nhau, khi được nuôi cùng một khoảng thời gian nuôi cay 3 tháng, kết quả sinh khối nam thu được khi nuôi trên môi trường rắn MYA nhiều
hơn khi nuôi trên môi trường lỏng ở điều kiện lắc (Bảng 3.1).
Một số nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng nắm phân lập từ địa y được nuôi cay trên môi trường ran (thạch) có tốc độ tăng trưởng cao hơn khi trong nuôi cấy trong môi trường lóng [9]. Vì vậy, sinh khối nắm cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi
trên tĩnh môi trường rin (MYA) nhiều hon sinh khối nam cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi trên lắc môi trường lỏng (MY long) là phù hợp với các nghiên cứu trước.
Sinh khối nắm và môi trường nuôi nắm (gồm cả môi trường rắn và môi trường lỏng) được chiết xuất 2 lần với một lượng dung môi ethyl acetate tương đương. Sau đó, dung môi trong dịch chiết được cho bay hơi bằng máy cô quay. Dung môi ethyl acetate còn lại được dé bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng và thu cao ethyl acetate khô.
Kết quả khối lượng các cao khô được thê hiện qua Bang 3.2.
Bảng 3.2. Khối lượng cao ethyl acetate thu được từ nắm cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi cấy sau 3 tháng trên môi trường MYA va MY lòng
STT Mẫu Khối lượng cao thu được (g)
| Môi trưởng long 5,3
2 Sinh khối nuôi trong môi trường lỏng 5.9
3 Môi trường MYA | 5,6 4 Sinh khối nuôi trên môi trường MYA | 6,7
Các mau cao ethyl acetate chiết xuất từ nắm cộng sinh của địa y Graphis sp.
được nuôi tĩnh trên môi trường MYA và nuôi lắc trên môi trường MY lỏng trong 3
tháng được pha loãng thành nồng độ 1000 pg/ml. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lan.
Chứng âm là methanol, ascorbic acid (vitamin C) được sử dụng làm chứng dương.
Kết quả tỉ lệ bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ nắm cộng sinh của địa y Graphis sp. được thẻ hiện ở Bảng 3.3.
Bang 3.3. Tỉ lệ % bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ nam
cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi trên môi trường MYA và MY lỏng Môi trường MYA Môi trường MY long
Sinh khối Môi trường Sinh khối Môi trường
Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy ở nông độ 1000 g/ml, hoạt tính kháng oxi hoá
của cao chiết ethyl acetate được chiết xuất từ sinh khối nam cộng sinh của địa y Graphis sp. khi nuôi tĩnh trên môi trường MYA cao hơn cao chiết ethyl acetate được chiết xuất từ sinh khối nam cộng sinh của địa y Graphis sp. khi nuôi lắc trên môi
trường MY long (23,996% > 14,224%).
Ngoài ra kết qua ở Bang 3.3 còn cho thấy, ở nồng độ 1000 jg/ml, hoạt tính kháng oxi hoá của cao chiết ethyl acetate được chiết xuất từ môi trường nuôi MYA ở điều kiện nuôi tĩnh cũng cao hơn cao chiết ethyl acetate được chiết xuất từ dich lọc
môi trường nuôi (MY lỏng) ở điều kiện nuôi lắc (39,187% > 29.850%).
Như vậy, khi nắm cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi trên môi trường MYA sinh trường nhanh hơn, tạo sinh khối nhiều hon va có hoạt tính loại gốc tự do DPPH cao hơn. Do đó, môi trường MYA được chon dé nuôi nắm cho các thí nghiệm tiếp theo trong dé tài.
3.2.2. Anh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính kháng oxi hoá
Nắm cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi trên môi trường rắn MYA ở nhiệt độ 22 — 23°C. Sinh khối nam và môi trường nuôi được thu ở các thời điểm 6 tuần. 8 tuần, 10 tuần, 12 tuần và 20 tuần. Kết qua về sinh khối nam được thẻ hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Sinh khối nam thu được khi nuôi trên môi trường MYA ở các khoảng
thời gian khác nhau
Thời gian nuôi cấy 6 tuần 20 tuần |
Các mẫu sinh khối nam và môi trường nuôi (MYA) nam cộng sinh của địa y
Graphis sp. được chiết xuất 2 lần với một lượng dung môi ethyl acetate tương đương.
Sau đó, dung môi trong dịch chiết được cho bay hơi bằng máy cô quay. Dung môi
ethyl acetate được bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng và thu cao ethyl acetate khô.
Kết quả được thé hiện qua Bang 3.5.
30
Bảng 3.5. Khối lượng cao ethyl acetate thu được từ nắm cộng sinh của địa y
Graphis sp. được nuôi trong các khoảng thời gian khác nhau
acetate (g)
Môi trường MYA
Sinh khối
Môi trường MYA
Sinh khối
Môi trường MYA
Sinh khối
Môi trường MYA
Môi trường MYA
Các mẫu cao này được pha loãng thành nông độ | 000 pe/ml và thir hoạt tính loại
góc tự do DPPH. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Tỉ lệ % bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate từ nấm Graphis sp.
được nuôi trên môi trường MYA ở các thời gian khác nhau
Thời gian thu mẫu
(tuần) Sinh khối Môi trường nuôi
6 1,887 + 0,356 15,023 + 0,397
8 6,047 + 0.560 23.856 + 0,329 10 14,078 + 0,895 35,268 + 1,028
12 33,140 + 1,022 42,424 + 0,598 20 34,494 + 0,4789 51,33 + 0,7143
31
Kết quả ở Bang 3.6 cho thay tỉ lệ phan trăm loại gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ sinh khối và môi trường nuôi nam tăng dần theo thời gian nuôi cay. Hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate từ môi trường nuôi nắm luôn mạnh hơn hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate từ sinh khôi nam ở tất cả các thời điểm thu mẫu. Điều này chứng tỏ các chất được nam tiết ra môi trường có hoạt tính kháng oxi hoá mạnh hơn so với các chất có trong sinh khối nắm. Tuy nhiên, ở các thời điềm thu mẫu 6 tuần, 8 tuần, 10 tuần và 12 tuần, cả cao ethyl acetate từ sinh khối nắm va môi trường đều có tỉ lệ loại gốc tự do DPPH thấp, đưới 50%. Chỉ riêng cao ethyl acetate chiết xuất từ môi trường nuôi nam được nuôi trong 20 tuần có hoạt tính kháng
oxi hoá mạnh (51,33%).
Một số nghiên cứu đã công bồ rằng nắm cộng sinh của địa y thưởng sinh trưởng
và phát triển rất chậm [47], [48]. Tốc độ sinh trưởng chậm có thé chính là lí do thời
gian sinh tông hợp các hoạt chất có hoạt tính sinh học của chúng cũng rất chậm. Do đó. trong nghiên cứu này khi khảo sát trên các thời điểm thu mẫu khác nhau, từ 6 tuần đến 20 tuần, nắm cộng sinh của địa y Graphis sp. chi thé hiện hoạt tính kháng oxi hoá
(loại 50%) gốc tự do DPPH khi được nuôi đến tuần thứ 20 (5 tháng).
Tiếp theo, cao ethyl acetate chiết xuất từ môi trường nuôi nắm thu ở 20 tuần được pha loãng thành các nòng độ từ 62,5 pg/ml đến 1000 pg/ml và thứ hoạt tính kháng oxi bằng phương pháp bay gốc tự do DPPH dé xác định giá trị ICsa. Kết quả cho thấy tỉ lệ phan trăm bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ môi
trường nuôi chủng nam này tăng dan theo nồng độ mẫu (Bảng 3.7). Cụ thê là khi tăng nông độ từ 62,5 ug/ml lên 1000 jig/ml thì tỉ lệ phan trăm hoạt tinh kháng oxi hoá tăng dan từ 5,854%% đến 51,33%.
Bang 3.7. Tỉ lệ % bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ môi trường nuôi nắm sau 20 tuần ở các nồng độ khác nhau
Néng độ (ug/ml) r : 250 | 500 | 1000
Ti lệ bẫy gốc tự do | 5.8544 | 8.1284 | 19,4484
DPPH (%) 2,193 1,485 3,318
31.301 +
4,770
51,33 + 0,714
Từ số liệu trong Bảng 3.7, tôi tiến hành xây dựng phương trình tuyến tính giữa
nồng độ mẫu và tỉ lệ bay góc tự do DPPH (%). Kết quả được thê hiện ở Hình 3.8.
60.000
y =0.0486x+4.3783
50.000 R* =0.9814 we’
4000 feet
.....
30.000 bd
. .
.. ..
TỈ lệ % bẫy gốc tự do DPPH 20.000 TT10.000
0.000
0 20 400 600 800 1000
Nồng độ mẫu (pg/ml)
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa tỉ lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH và nồng độ của cao ethyl acetate chiết xuất từ môi trường nuôi nam sau 20 tuần
Kết quả ở Hình 3.8 cho thay hoạt tính khang oxi hoá của cao ethyl acetate chiết xuất từ môi trường nuôi nắm sau 20 tuần tăng tuyến tính theo chiều tăng nông độ mẫu với hệ số xác định cao (R = 0.9814). Từ phương trình tuyến tính y = 0,0486x +
4.3783, tôi xác định được giá trị ICso trong phương pháp bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ môi trường nuôi nấm sau 20 tuần là 938,718 pg/ml.