CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU À PHƯƠNG PHÁP NGH ÊN CỨU NGUYÊN LIỆU À PHƯƠNG PHÁP NGH ÊN CỨU
2.6. PHÂN TÍCH SẮC KÝ LỚP MỎNG CÁC PHÂN Đ ẠN CAO TÁCH
TỪ TỔNG CAO ETHANOL
2.6.1. M c đích
Sắc ký lớp mỏng là m t ĩ th ật được dùng để định tính, thử đ tinh khiết, tách chất trong hỗn hợp và đôi hi để bán định ượng các hoạt chất.
2.6.2. Cách tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị bản mỏng
Bản mỏng được mua trên thị trường là loại tráng sẵn si icag ch thước 20 x 20 cm hoặc 5 x 10 cm.
Hình 2.6. Bản mỏng slicagel Kieselgel 60F254
Với loại ch thước 20 x 20 cm ta cắt bản mỏng ra thành các bản nhỏ với kích thước cần thiết ư ý cắt sao cho bản mỏng phải lọt được vào bình giải ly. Dùng bút chì vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1 cm và mức tiền tuyến cách mép trên 0,5 cm.
Bước 2 huẩn ị ình ắc ký và dung môi giải ly
ình triển khai dạng hình h i trụ (đường nh ớn hơn bề ngang bản mỏng sử dụng) K ch thước của bình và thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng đến giá trị Rf của mẫu.
Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Với sắc ký lớp mỏng định tính chỉ cần m t thể tích khoảng 10 ml dung môi. Quan sát chiều dày của lớp dung môi không được cao quá 1 cm vì các vết chấm mẫu trên bản mỏng cách bìa 1 cm.
SV: Huỳnh Thị Thanh Nguyệt Lớp: 16CHDE Trang 29 rước khi cho bản mỏng vào bình, bình cần được bảo hòa dung môi, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng m t tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc. Nế bình hông được bão hòa dung môi, khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm ( hình lòng chảo) do d ng môi đi ở hai bên cạnh nhanh hơn đi ở giữa bản.
Với mẫ chưa biết thành phần, chưa có tài iệ tham hảo, cần thử nghiệm với nhiề oại d ng môi hác nha , từ hông phân cực đến phân cực H xan, Ch oroform, Dichloromethane, Ethyl Acetate, Acetone, Methanol. Dùng m t mặt nh đồng hồ đậy kín bình triển hai để dung môi không bị bay ra trong quá trình sử dụng.
Hình 2.7. Các bình dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng
Bước hấm mẫu l n ản mỏng
Mỗi bản mỏng trước khi chấm mẫu phải hoạt hóa (sấ hô bản bằng má sấ tóc chừng nửa phút). Dùng vi mao q ản nhúng m t đầ vào mẫ cao đ được hòa tan trong dung môi thích hợp, ực mao dẫn sẽ hút d ng dịch vào vi q ản Chấm nhẹ đầ mao quản chứa d ng dịch ên trên bản mỏng tại m t điểm cách bản 1 cm
Lưu ý: Chạm nhẹ vi q ản vào bề mặt bản mỏng để chỉ tạo thành m t điểm tròn nhỏ (vì nế chạm â , điểm nà sẽ an to và nhìn thấ ỗ trên bề mặt) Chờ dung môi trên vết chấm ba hơi hoặc sấy nhẹ để d ng môi ba hơi nhanh hông an thành vết chấm to Có thể chấm thêm vài ần (2 - 5 lần tùy nồng đ mẫu cao trong dung dịch) ên nga vết chấm cũ để có vết đậm, rõ, nhưng đường nh hông q á 2 mm Nế cần chấm cùng nhiề vết chấm ên m t bản thì các vết chấm phải cách đá bản 1,0 cm, cách đề nha 1,0 cm và cách hai cạnh bên 0,5 cm
Bước 4: Triển khai sắc ký giải ly bản mỏng
SV: Huỳnh Thị Thanh Nguyệt Lớp: 16CHDE Trang 30 Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầm thẳng đứng bản mỏng rồi mới nhúng vào d ng môi trong bình Khi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh bên của bản hông chạm vào thành bình, úc đó vị tr của các vết chấm mẫ nằm trên cao cách mặt thoáng của d ng môi hoảng 0,2 - 0,5 cm.
Đậ nắp bình triển hai, d ng môi sẽ được hút ên bản bởi ực hút mao dẫn h o dõi hi mực d ng môi ên đến vạch tiền t ến đ được vạch sẵn trước đó (cách đầ bản 0,5 cm) thì ập tức ấ bản ra hỏi bình, sấ hô bản bằng má sấ tóc
Bước 5 ch nhận dạng vết ắc k
Sau khi kết thúc quá trình sắc ký, phải tiến hành nhận dạng vết sắc ký bằng các phương pháp hóa học và vật lý phù hợp.
Đối với phương ph p hóa học, phun xịt lên bản mỏng m t dung dịch thu c thử có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường.
Trong phương ph p vật lý, ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tia tử ngoại. Ngoài ra có thể dùng m t chất chỉ thị phát quang tác dụng được với các cấu tử trong hỗn hợp hoặc nhận dạng vết sắc ký bằng phương pháp phóng xạ.
Hình 2.8. Đèn tử ngoại dùng phát hiện vết chất trên SKLM
Bước 6: Lựa chọn dung môi phù hợp
Dựa trên các vết chất xuất hiện trên các bản mỏng (bản mỏng có chấm các mẫu chất như nha và được giải ly bằng các d ng môi đơn ha hỗn hợp d ng môi có đ phân cực khác nhau) ta xác định được dung môi phù hợp để giải ly mẫu như sa
SV: Huỳnh Thị Thanh Nguyệt Lớp: 16CHDE Trang 31 + Dung môi phù hợp khi nó làm cho các chất có mặt trong mẫ ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau nhất m t cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/4 - 3/4 hoặc 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký.
+ Các dung môi không phù hợp nếu tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát (dung môi chưa đủ phân cực) hoặc tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền tuyến (dung môi quá phân cực).
Bước 7 X c định hệ số di chuyển (Rf)
Sử dụng bản mỏng giải ly với dung môi phù hợp nhất, nhận xét về mà sắc và xác định hệ s di chuyển từ giá trị Rf của các vết th được Đại ượng đặc trưng cho mức đ di chuyển của chất phân tích là hệ s di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của vết chất và khoảng dịch chuyển của dung môi:
Rf = a/b (Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1) rong đó
a: Khoảng cách (cm) từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu.
b: Khoảng cách (cm) từ điểm xuất phát đến mức dung môi.