CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Khảo sát thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết
- Phản ứng Shinoda
Dây Mặt quỷ khô
Cao ethanol
Cao phân đoạn
n - hexan Lớp nước
Cao phân đoạn ethylaxetat
Cao ph©n
đoạn nước Lớp nước
Cao phân đoạn cloroform
Pha mẫu thử trong ethanol với lượng thích hợp. Sau đó cho vào vài giọt axit HCl đặc, chia dung dịch nhận được vào 2 ống:
+ Ống 1: Dùng để làm ống đối chứng
+ Ống 2: Thêm vài mảnh Mg, đun trên nồi cách thuỷ trong vài phút.
Phản ứng cho kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.[33]
- Phản ứng diazo hóa
Dung dịch thử được pha như trên. Chia dung dịch nhận được vào 2 ống:
+ Ống 1: Dùng làm ống đối chứng
+ Ống 2: Nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính.[33]
- Phản ứng với acid sunfuric
Dung dịch thử được pha như trên. Chia dung dịch nhân được vào 2 ống:
+ Ống 1: Dùng làm ống đối chứng.
+ Ống 2: Nhỏ thêm vài giọt dung dịch axit sulfuric
Phản ứng có màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của các flavone và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcone và aurone. [33]
- Phản ứng với dung dịch kiềm
Dung dịch thử được pha như trên. Chia dung dịch nhân được vào 2 ống:
+ Ống 1: Dùng làm ống đối chứng
+ Ống 2: Nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH10%.
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam. [33]
2.2.2.2. Định tính tannin
Dung dịch được pha như trên, cho dung dịch vào 2 ống nghiệm.
- Phản ứng với vanilin
+ Ống 1: Đối chứng.
+ Ống 2: Thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4.
Phản ứng cho kết quả dương tính khi sản phẩm có màu đỏ đậm.
- Phản ứng với FeCl3
+ Ống 1: Đối chứng.
+ Ống 2: Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 1%.
Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu lục, tía, lam, xanh hay đen.
- Phản ứng với genlatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
- Phản ứng với chì acetate: Cho vài giọt dung dịch chì acetate 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
2.2.2.3. Định tính glycosid (Phản ứng Keller – Killian)
Dung dịch A: 50 ml CH3COOH 10% + 0,5 ml FeCl3 5%.
Dung dịch B: 50 ml H2SO4 đặc + 0,5 ml FeCl3 5%.
Cho 0,01 g mẫu thử vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch A hòa tan hết mẫu, nghiêng ống nghiệm cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng dương tính là xuất hiện màu nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.2.4. Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% để tiến hành các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorf
Phản ứng của ankaloid cho kết tủa có màu đặc trưng, đó là phản ứng Dragendrorf
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
Hoá chất: HCl 1%; CH3COOH đặc; KI
Dụng cụ: Bình cầu hoặc bình nón dung tích 100ml, nồi cách thuỷ (1000C)
Chuẩn bị thuốc thử Dragendorf: Pha dung dịch hỗn hợp gốc gồm:
a) dung dịch bismut nitrat trong axit (cân 0,85 g bismuth nitrat hoà tan trong 40ml nước, thêm 10ml CH3COOH đặc, lắc đều).
b) dung dịch kali iôđua (cân 20g KI hoà tan trong 50ml nước).
Sau đó trộn lẫn hai dung dịch a và b với nhau ta được dung dịch gốc. Lấy 20ml dung dịch gốc này, thêm 10ml nước và 20ml CH3COOH đặc, lắc đều, nhận được dung dịch thuốc thử để sử dụng
Cách làm: Chiết ankaloid từ nguyên liệu thực vật. Cân 1g nguyên liệu tươi, cắt nhỏ, cho vào bình cầu hoặc bình nón, thêm vào đó 25ml HCl 1%, đun trên nồi cách thuỷ đang sôi trong 5 phút. Để nguội, lọc qua giấy lọc, thu lấy dung dịch để làm phản ứng định tính.
+Phản ứng Dragendorf: Trong môi trường axit rất nhiều ankaloid cho kết tủa màu đỏ da cam hoặc đỏ gạch với thuốc thử Dragendorf có chứa KI và Bi(NO3)3.
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch chiết ankaloid, nhỏ từng giọt thuốc thử, quan sát sự tạo kết tủa.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl):
phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.
- Phản ứng với Vans – Mayer
Thêm vài giọt thuốc thử Vans – Mayer vào dung dịch chữa mẫu thử, phản ứng cho kết quả dương tính khi sản phẩm có kết tủa màu trắng hay vàng nhạt [32].