CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp
* Xây dựng đường chuẩn acid gallic:
- Hóa chất:
+ Dung dịch gốc acid gallic nồng độ 5000 mg/l gồm: 0,5 g acid gallic + 10 ml ethanol + 90 ml H2O.
+ Dung dịch Na2CO3 20%, dung dịch thuốc thử Folin - Ciocalteau.
- Tiến hành:
+ Pha loãng dung dịch acid gallic theo các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l.
+ Chuẩn bị 6 cóng định lượng đánh số từ 1 đến 6, lần lượt mỗi cóng cho 20 àl dung dịch acid gallic với cỏc nồng độ nờu trờn + 1,58 ml H2O + 100 àl thuốc thử Folin – Ciocalteau. Sau 5 phỳt cho thờm 300 àl dung dịch Na2CO3. Để hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi đo OD bước sóng 765 nm [69].
+ Dựng đường chuẩn acid gallic.
Hình 2.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
* Định lượng polyphenol tổng số:
Cân 10 mg mẫu thử thuộc mỗi phân đoạn dịch chiết hòa tan trong 1 ml ethanol 80%, bổ sung thêm nước cất vào cho đủ 10 ml dung dịch để thu được dung dịch gốc có nồng độ chất tan là 10.000 mg/l. Lấy 1 ml dung dịch gốc hòa với 9 ml nước cất thu được dung dịch cao có nồng độ 1000 mg/l.
Tiến hành thí nghiệm tương tự như đối với dung dịch acid gallic, xác định giá trị OD, từ đó tính nồng độ polyphenol trong dung dịch và thành phần phần trăm về khồi lượng polyphenol trong mỗi phân đoạn dịch chiết.Theo đó:
Hàm lượng polyphenol trong dung dịch = 1000x( OD – 0,0128) (mg/l) STT mg/l acid
gallic OD765nm
1 0 0,009
2 50 0,060
3 100 0,115
4 150 0,168
5 250 0,263
6 500 0,519
Thành phần % polyphenol trong mẫu =
Hàm lượng polyphenol 10
2.2.5. Tạo mô hình chuột BP và ĐTĐ thực nghiệm
Chuột được chia làm 11 lô, mỗi lô 6 con. Chuột gây bệnh được cho uống cao phân đoạn ethanol và ethylaxetat và n – hex của loài Morinda umbellata L.
với liều lượng 1000 mg khô tuyệt đối/kg thể trọng/ngày.
* Mô hình chuột béo phì
+ Lô 1: Chuột ăn thức ăn chuẩn ( mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) và uống nước : Lô đối chứng (-) (chung cho cả hai mô hình)
+ Lô 2: Chuột béo phì.
+ Lô 3: Chuột béo phì không điều trị ( uống nước trong vòng 21 ngày): Lô đối chứng (+)
+ Lô 4: Chuột béo phì điều trị bằng Metformin (Merk) với liều 500mg/kg thể trọng.
+ Lô 5: Chuột béo phì uống dịch chiết cao cồn tổng số (80%) với liều 1000mg cao khô /kg thể trọng/1 ngày trong vòng 21 ngày.
+ Lô 6: Chuột béo phì uống dịch chiết phân đoạn ethylaxetat với liều 1000mg cao khô /kg thể trọng/1 ngày trong vòng 21 ngày
* Mô hình chuột ĐTĐ
+ Lô 1: Chuột ĐTĐ typ2 (ăn chế độ giàu chất béo và tiêm STZ liều thấp 100 - 110mg/kg), uống nước cất trong vòng 21 ngày. Lô đối chứng (+)
+ Lô 2: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng Metformin (Merk) với liều 500mg/kg thể trọng.
+ Lô 3: Chuột ĐTĐ type 2 uống dịch chiết cao cồn tổng số (80%) với liều 1000mg cao khô /kg thể trọng/1 ngày trong vòng 21 ngày.
+ Lô 4: Chuột ĐTĐ type 2 uống dịch chiết phân đoạn n - hexan với liều 1000mg cao khô /kg thể trọng/1 ngày trong vòng 21 ngày.
+ Lô 5: Chuột ĐTĐ type 2 uống dịch chiết phân đoạn ethylaxetat với liều 1000mg cao khô /kg thể trọng/1 ngày trong vòng 21 ngày.
Chuột nuôi ở chế độ ăn thường: Nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp.
Chuột vỗ béo: Nuôi bằng thức ăn với hàm lượng lipid và cholesterol cao trong thời gian 6 tuần.
Chuột gây ĐTĐ: Nuôi băng thức ăn với hàm lượng lipid và cholesterol cao trong thời gian 6 tuần, tiêm STZ màng bụng với liều lượng 100mg/kg thể trọng.
2.2.6. Xác định độc tính cấp LD50 của dịch chiết EtOH dây Mặt quỷ.
Xác định LD50 của dịch chiết dõy Mặt quỷ theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm. Chuột được nhịn đói trước 16h thí nghiệm và được cho uống theo liều tăng dần đến từ 4 - >20g/kg thể trọng, theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiÕt dây Mặt quỷ.[58]
2.2.7. Nghiên cứu các chỉ số sinh lý của chuột BP và ĐTĐ Cân trọng lượng chuột 1 lần/tuần bằng cân điện tử.
Đo đường huyết sau khi tiêm STZ 72 giờ, liên tục 6 lần trong 10 giờ tiếp theo bằng máy đo Onetouch Ultra, mỗi lần cách nhau 2 giờ. Tiếp tục cho chuột uống cao các phân đoạn với liều lượng 1000 mg/kg thể trọng/ngày và đo nồng độ đường huyết sau 5, 10, 15, 21ngày.
Đo các chỉ số nồng độ cholesterol, triglycerid, HDLC, LDLC, bằng máy đo Human tự động tại khoa xét nghiệm, bệnh viện Hữu Nghị Việt Xô.
Việc xét nghiệm nồng độ lipoprotein lipase (LPL – EC.3.1.1.34) trong máu chuột dựa trên các tham số kỹ thuật về phương pháp, hóa chất, bước sóng xét nghiệm của máy ADVIA 1650 của Siemens.
Nguyên lý của quá trình định lượng lipoprotein lipase: chất chromogenic lipase, DGGMR, (1,2-o-dilauryl-rac-glycero-3glutaric acid-(6- methylresorufin) ester) được tách ra bởi xúc tác của lipase thành dạng 1,2-o- dilauryl-rac-glycerol và chất trung gian không bền, glutaric acid-(6-methyl resorufin) ester. Chúng tự động phân ly trong dung dịch kiềm thành dạng glutaric và methylresorufin. Nồng độ của lipase trong mẩu tương ứng với methylresorufin được tạo ra trong phản ứng. độ hấp thụ của phức hợp này sẽ được xác định ở bước sóng xác định.
Xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê toán học trên phần mềm Microsoft excel.