3.1. ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU XÁC ĐỊNH VIT.C BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỰC PHỔ (VÔN-AMPE)
3.1.2. Ảnh hưởng của oxi hòa tan
Khi đo sóng cực phổ của Vit.C trong nền đệm axetat, nếu không đuổi khí oxi hòa tan thì sóng cực phổ rộng và tù khi đuổi oxi hoàn toàn tức là sau thời gian 300s, pic gọn và đẹp, chân pic hẹp, cân đối. Chứng tỏ oxi hòa tan có ảnh hưởng đến pic của Vit.C và thời gian đuổi khí trước khi quét thế là có liên quan đến chất lƣợng pic.
Thực tế là nồng độ oxi hòa tan trong nước khá lớn, khoảng 1,38.10-3M ở 20oC. Quá trình khử oxi xảy ra theo 2 bước, bước thứ nhất tạo ra hiđro peoxit, bước tiếp theo khử hiđro peoxit thành nước, theo 2 bán phản ứng sau:
O2 + 2H+ + 2e → H2O2
H2O2 + 2H+ + 2e → 2H2O
Oxi hòa tan trong nước ảnh hưởng đến quá trình phân tích Vit.C, thứ nhất là chất lượng đường cực phổ của Vit.C, thứ hai oxi hòa tan phản ứng với axit ascobic trong dung dịch, làm giảm đáng kể nồng độ trong quá trình phân tích.
Vì vậy, trước khi đo cần thiết phải đuổi oxi khỏi nền, thời gian đuổi oxi cho phép đo cực phổ thường là 4÷8 phút. Thực nghiệm cho thấy ở khoảng nồng độ chất phân tích chỉ 10-5M thì không cần nhiều thời gian nhƣ vậy.
Em tiến hành khảo sát ảnh hưởng của oxi hòa tan, đến sóng cực phổ của Vit.C ở nồng độ 2 mg/l. Đo chiều cao sóng cực phổ của Vit.C sau 0s, 30s, 60s, 90s, 120s, 150s, làm lặp 4 lần thu đƣợc kết quả trong bảng 3.2.
Thời gian đƣợc chọn khi mà lƣợng oxi còn lại trong dung dịch không ảnh hưởng đáng kể đến pic của Vit.C.
Bảng 3.2: Khảo sát sóng cực phổ của Vit.C theo thời gian đuổi oxi
t (s)
iP (nA)
( ) i nAP
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4
0 168 __ __ __ 168
30 69,4 71,9 __ __ 70,7
60 52,6 53 53,8 55,3 53,7
90 50,2 49,5 49,5 52,6 50,5
120 49,4 48,2 49,6 50,9 49,5
150 49,8 __ __ 50,2 50,0
Nhận xét:
Sau 30s thì có xuất hiện pic của Vit.C nhƣng chân pic rộng, không cân đối, phải sau 90s, 120s, 150s, chiều cao pic mới ổn định (bảng 3.2).
Có thể kết luận sau 90s, tại khoảng nồng độ Vit.C là 2 mg/l (khoảng 10-
5M) thì oxi hòa tan không còn ảnh hưởng đến sóng cực phổ của Vit.C nữa.
Vì vậy để rút ngắn thời gian thời gian phân tích em chọn đuổi khí trước khi quét thế cho tất cả các phép đo tiếp theo là 90s.
3.1.3. pH của nền đệm axetat
pH của dung dịch nền ảnh hưởng nhiều đến sóng cực phổ của hợp chất hữu cơ. Khi pH thay đổi, vị trí của pic chuyển dịch theo chiều dương hoặc âm tùy theo sự có mặt của ion H+ trong phương trình cho nhận e- của hợp chất hữu cơ và tùy theo quá trình phân cực catot hay anot.
Phản ứng xảy ra trên điện cực của Vit.C là:
C6H8O6 → C6H6O6 + 2H+ + 2e-
Để khảo sát ảnh hưởng pH của dung dịch đệm trên sóng cực phổ của Vit.C, em tiến hành đo sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 2, 4, 6mg/l trong các nền đệm axetat 0,1M có pH bằng 3,18; 4,01; 4,66; 5,26; 5,93 tương ứng với tỷ lệ CHAc:CAc là 9,5:0,5; 8:2; 5:5; 2:8; 0,5:9,5. Làm lặp lại 3 lần thu đƣợc kết quả trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 : Kết quả khảo sát sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 2, 4, 6 mg/l theo pH của đệm axetat
VHAc:VAc pH EP (mV) CVit.C (mg/l) ip (nA)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 9,5:0,5 3,18 23,8
2 63,9 62,2 63,2
4 119 116 117
6 169 168 167
8:2 4,01 -11,9
2 60,5 60,7 59,6
4 115 113 110
6 164 158 164
5:5 4,66 -41,7
2 55,7 55,4 54,6
4 105 103 101
6 152 152 146
2:8 5,26 -65,5
2 53,9 55,6 54,2
4 102 102 97,9
6 145 143 140
0,5:9,5 5,93 -89,3
2 53,2 54,2 53,1
4 97,7 99,1 97,5
6 141 139 137
Nhận xét :
Khi pH tăng, thế đỉnh píc của Vit.C chuyển dịch về phía âm hơn, tại pH
= 3,18, EP = +23,8mV, khi tăng đến pH = 5,93 thì EP = -89,3mV. Sự dịch
chuyển píc về vùng dương trong môi trường axit hơn do ion H có mặt trong bán phản ứng oxi hóa khử của Vit.C. Tốc độ quá trình oxi hóa Vit.C chậm hơn trong môi trường axit, do đó EP chuyển dịch về phía dương hơn khi phân cực anot. Tuy nhiên chất lƣợng pic vẫn tốt, pic gọn và hẹp (hình 3.2), chiều cao pic không thay đổi đáng kể, độ lặp tốt (bảng 3.3).
Vị trí pic của Vit.C xác định đƣợc một cách dễ dàng. Vì vậy để thuận tiện cho việc pha chế dung dịch đệm em dùng đệm axetat có pH = 4,66 tương ứng với tỷ lệ thể tích dung dịch HAc:Ac- là 5:5, đồng thời khi CHAc=CAc thì dung dịch có đệm năng tốt nhất.
Hình 3.2: Sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 2, 4, 6 mg/l trong đệm
Axetat 0,1M; pH=4,66
Hình 3.3: Sóng cực phổ của Vit.C trong đệm Axetat 0,1M
3.1.4. Nồng độ dung dịch đệm axetat
Để loại trừ ảnh hưởng của dòng điện chuyển, nồng độ chất điện li nền thường lớn hơn chất phân tích từ 25÷50 lần. Tức là ở nồng độ khoảng 10-5M, thì nồng độ chất điện li 10-3M là đủ để triệt tiêu dòng điện chuyển.
Tuy nhiên thực nghiệm cho thấy, sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 5, 10, 15mg/l tương ứng với 2,8.10-5M; 5,7.10-5M; 8,5.10-5M trong nền đệm axetat 0,01M, pH = 4,66 tương ứng với nồng độ ion trơ (Na+) trong dung dịch là 5.10-3M, gấp gần 60 lần chất phân tích thì đã cho kết quả phân tích không tốt. Sóng cực phổ không cân đối và không tuyến tính (hình 3.3).
Để tìm đƣợc nồng độ axetat tốt nhất cho phép đo xác định Vit.C, em tiến hành khảo sát sóng cực phổ của Vit.C theo nồng độ dung dịch đệm axetat pH = 4,66. Chuẩn bị các dung dịch đệm axetat (5:5) có nồng độ tổng CHAc + CAc = 1M; 0,5M; 0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,01M; 0,005M. Đo sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 5, 10, 15 mg/l. Kết quả đo cho trong bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 5, 10, 15 mg/l trong nền đệm axetat có nồng độ khác nhau CHAc+CAc (M)
iP (nA) Phương trình r2
CVit.C (mg/l) 5 10 15
1 146 293 427 y = 29,2x + 3 0,9996
0,5 163 320 461 y = 31,0x + 12 0,9994
0,2 172 335 508 y = 35,0x – 3,2 0,9995
0,1 185 370 541 y = 37,0x + 3,4 0,9997
0,05 224 417 607 y = 39,8x + 26,6 1,0000
0,01 322 532 689 y = 38,2x + 141 0,9940
0,005 328 497 608 y = 29,1x + 193 0,9872
(Số liệu được xử lý bằng chương trình Excel)
Nhận xét:
Tại một nồng độ của Vit.C, nồng độ nền giảm thì chiều cao pic tăng lên, do sự tăng hệ số khuếch tán D khi độ nhớt của dung dịch giảm, tuy nhiên dung dịch đệm quá loãng thì pic bị nghiêng, không cân đối (hình 3.3). Hơn nữa, khi thêm dần lượng Vit.C vào thì độ tăng chiều cao pic không còn tương ứng với nồng độ thêm vào nữa, biểu hiện ở hệ số b trong phương trình ở bảng 3.4 càng khác 0 khi nồng độ nền càng giảm. Tại nồng độ 1M giá trị b chỉ bằng 2% giá trị iP (tại nồng độ của Vit.C là 5 mg/l) thì khi nồng độ nền giảm xuống 5.10-3M giá trị b bằng 59%.
Ngƣợc lại, khi nồng độ nền cao mặc dù sẽ triệt tiêu đƣợc tối đa dòng điện chuyển nhƣng điều đó cũng có nghĩa là các tạp chất do nền mang lại sẽ lớn. Đặc biệt là các ion kim loại, vì chỉ với hàm lƣợng rất nhỏ chúng cũng cho tín hiệu cực phổ.
Vì vậy, để tiết kiệm hóa chất nhƣng vẫn đảm bảo mục đích phân tích, em chọn nồng độ đệm axetat thích hợp là 0,1M. Khi đó nồng độ chất điện li trơ trong dung dịch là 5.10-2M.
3.1.5. Khoảng nồng độ tối ƣu 3.1.5.1. Xây dựng đường chuẩn
Để tìm đƣợc khoảng nồng độ của Vit.C tối ƣu xác định Vit.C bằng phương pháp cực phổ, em tiến hành khảo sát khoảng nồng độ mà chiều cao sóng cực phổ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của Vit.C.
Chuẩn bị 3 dung dịch Vit.C có nồng độ chuẩn 1000mg/l; 200mg/l;
50mg/l. Hút 10ml dung dịch đệm axetat 0,1M; pH = 4,66 vào bình đo, đuổi khí oxi hòa tan trong 90s, thêm 3 lần, mỗi lần 0,1ml dung dịch Vit.C chuẩn vào bình, đo sóng cực phổ của Vit.C trong nền đệm axetat. Lặp lại 2 lần với mỗi dung dịch Vit.C chuẩn thu đƣợc kết quả trong bảng sau:
xi: nồng độ Vit.C (mg/l)
yi: chiều cao sóng cực phổ của Vit.C (nA)
Bảng 3.5: Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn phụ thuộc chiều cao sóng cực phổ của Vit.C (yi, nA) vào nồng độ Vit.C (xi, mg/l)
STT xi y1i y2i yi xi
2 xiyi ŷi (yi - ŷi)2 1 0,50 19,0 20,6 19,8 0,245 9,80 22,0 4,907 2 0,98 33,2 31,8 32,5 0,961 31,86 34,0 2,339 3 1,46 44,3 44,9 44,6 2,121 64,95 45,8 1,465 4 1,98 59,9 56,6 58,5 3,921 115,35 58,8 0,279 5 3,92 109 106 107,5 15,379 421,57 106,8 0,443 6 5,83 159 154 156,5 33,933 911,65 154,0 6,462 7 9,90 256 259 257,5 98,030 254,50 254,8 7,032 8 19,6 504 492 498,0 38,468 9764,71 495,1 8,237 9 29,1 731 724 727,5 848,336 21189,32 730,7 10,536
Xử lý số liệu theo phương pháp bình phương tối thiểu, lập phương trình tuyến tính trên Excel, thu đƣợc kết quả:
Đường chuẩn: y = (24,754 0,008)x + (9,8 2,5) Hay: ip = ( 24,754 0,008)CVit.C + (9,8 2,5)
Hình 3.4: Đường chuẩn iP = f(CVit.C)
Đường chuẩn có độ tuyến tính tốt trong khoảng rộng từ 0,5 mg/l ÷ 30 mg/l (tương đương 2,8.10-6M ÷ 1,7.10-4M), giúp cho việc pha mẫu thực tế đơn giản không quá phức tạp.
Thực nghiệm cho thấy khi đo đường cực phổ của Vit.C tại nồng độ 40 mg/l (2,3.10-4M) thì pic xuất hiện vai. Khi nồng độ lớn đến một lúc nào đó, chiều cao pic không còn phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của Vit.C, hơn nữa quá trình oxi hóa Vit.C trên điện cực không còn ổn định và không tuân theo quy luật.
3.1.5.2. Kiểm tra đường chuẩn
Để kiểm tra độ chính xác của đường chuẩn, pha dung dịch Vit.C có nồng độ coi như nồng độ thực (àX), đo đường cực phổ của Vit.C trong dung dịch đó, dùng đường chuẩn xác định được nồng độ CX. So sánh Cx tìm được theo đường chuẩn với giỏ trị thực àX với độ tin cậy thống kờ cho trước để kết luận độ chính xác của đường chuẩn tìm được.
Tiến hành ghi đường cực phổ của Vit.C tại 2 nồng độ àx1 = 1,2mg/l và àx2 = 4,8mg/l, lặp lại 8 lần. Thay từng giỏ trị y đo được vào phương trỡnh đường chuẩn iP = (24,754 ± 0,007).CVit.C + (10 ± 2), thu được giá trị nồng độ CX1, CX2 nhƣ trong bảng 3.6
Bảng 3.6: Đánh giá độ chính xác của đường chuẩn iP = f(CVit.C)
Giá trị đo lặp lại Nồng độ Vit.C thực (mg/l)
1,20 4,80
1 2 3 4 5 6 7 8
1,180 1,176 1,216 1,167 1,224 1,188 1,180 1,200
4,856 4,815 4,735 4,735 4,815 4,775 4,856 4,735
Giá trị trung bình 1,191 4,790
Giới hạn tin cậy 0,017 0,044
Độ lệch chuẩn S 0,020 0,053
Độ lệch chuẩn giá trị trung bình 0,007 0,019
Sai số tương đối q% 1,05 0,84
Sai số tương đối giữa lí thuyết
và thực nghiệm % 0,73 0,21
Hằng số Student thực nghiệm 1,230 0,530
Hằng số Student lí thuyết 2,365 2,365
So sánh tTN với tb(0,05; 7) = 2,365 thì tTN < tb. Vậy sự khác nhau giữa giá trị nồng độ C tớnh theo đường chuẩn và giỏ trị àX đó pha là do ngẫu nhiờn với độ tin cậy 95%. Xác định nồng độ trong khoảng 0,5 ÷ 30mg/l (2,84.10-6 ÷ 1,70.10-4M) có độ đúng tốt, phương pháp đo không mắc sai số hệ thống.
Khi xác định mẫu thực tế, tiến hành đo khảo sát trước, sau đó pha loãng dung dịch mẫu sao cho nồng độ nằm trong khoảng tối ƣu xác định.
3.1.5.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp Sử dụng đường chuẩn, tính theo quy tắc 3σ
min 6
3 0, 2589 / 0, 26 / 1, 48.10
C mg l mg l M
a
Thực nghiệm cho thấy trong điều kiện xác định đường chuẩn, khi đo sóng cực phổ của Vit.C tại nồng độ 0,25 mg/l thì không xác định đƣợc pic của Vit.C. Kết quả này phù hợp với lý thuyết tính độ nhạy của phương pháp là 0,26 mg/l.
Các kết quả về đường chuẩn, giới hạn phát hiện được tính dựa trên kết quả ghi đường cực phổ theo chương trình đo ở bảng 2.1. Vì vậy khi thay đổi chương trình đo, gồm kích thước giọt, biên độ xung, tốc độ quét… dẫn đến thay đổi giá trị chiều cao pic đo được, vì vậy hệ số a, b của đường chuẩn cũng nhƣ giới hạn phát hiện có thể thay đổi. Tuy nhiên mục đích của bản khóa luận không phải tăng độ nhạy mà chỉ cần xác định khoảng nồng độ tối ƣu xác định Vit.C tại một điều kiện đo cố định đã chọn. Kết quả này định hướng cho các nghiên cứu trên mẫu thực tế tiếp theo.
3.1.6. Khảo sát các chất ảnh hưởng
Nghiên cứu tài liệu cho thấy trong các đối tƣợng thực tế nhƣ: thuốc, các loại quả, các loại dược phẩm và một số loại nước đóng hộp, một số chất thường xuất hiện cùng Vit.C. Đặc biệt là các vitamin nhóm B trong thuốc, hay các axit hữu cơ trong rau quả, có hàm lượng tương đối lớn, bằng hoặc nhiều hơn cả lƣợng Vit.C. Tuy nhiên các vitamin có trong thuốc cùng với Vit.C không thể hiện tính chất cực phổ tại vùng thế nghiên cứu, do vậy các vitamin đó không ảnh hưởng đến phép đo. Trong rau, quả thành phần mẫu rất phức tạp, ảnh hưởng nhiều đến quy trình đo.
3.1.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của các axit hữu cơ
Axit oxalic, axit tactric, axit xitric là 3 axit hữu cơ có nhiều nhất trong các loại rau quả. Công thức cấu tạo và pKa tương ứng là:
COOH
C CH2COOH HOOCH2C
OH
C HO H
CH OH
COOH HOOC COOH
Axit xitric Axit D- tactric Axit oxalic HOOC
pKa1=3,128 pKa1=3,036 pKa1=1,27 pKa2=4,761 pKa2=4,366 pKa2=4,25 pKa3=6,396
Tiến hành thực nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chúng lên pic của Vit.C. Đo đường cực phổ của Vit.C 2 mg/l khi có mặt các axit đó với tỷ lệ khối lƣợng gấp k lần.
Kết quả đƣợc đƣa ra trong bảng 3.7
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của axit oxalic, axit xitric, axit tactric lên sóng cực phổ của Vit.C
Axit tactric Axit xitric Axit oxalic
Ca/C0 iP (nA) %iP/i0P Ca/C0 iP (nA) %iP/i0P Ca/C0 iP (nA) %iP/i0P
0 115 0,00 0 114 0,00 0 115 0,00
25 109 5,50 25 103 9,65 50 112 2,61
50 108 6,48 50 103 9,65 100 107 6,96
200 102 12,75 100 102 10,53 150 105 8,70 400 99,5 15,58 200 101 11,40 200 103 10,43 500 98 17,35 300 101 11,40 250 102 11,30 400 98,3 13,77 300 98,8 14,09 500 97,8 14,21
Nhận xét:
Kết quả cho thấy khi có mặt các axit hữu cơ khác gấp đến hàng trăm lần về khối lƣợng, pic của Vit.C ở nồng độ 2 mg/l vẫn cho kết quả tốt, pic vẫn cân đối, thế dịch chuyển ít về phía dương hơn, chiều cao pic có bị giảm đi.
Trường hợp có mặt axit oxalic gấp 200 lần về khối lượng thì chiều cao pic mới giảm 10%, ở axit tactric là khoảng 150 lần còn axit xitric là 100 lần. Pic của Vit.C bị giảm chỉ do khi hàm lƣợng các axit oxalic, axit xitric, axit tactric lớn, độ nhớt của dung dịch tăng và làm giảm hệ số khuếch tán. Phân tử của chúng càng cồng kềnh, độ linh động của dung dịch càng kém do đó nó ảnh hưởng mạnh hơn đến chiều cao pic, có thể thấy axit xitric cồng kềnh hơn axit oxalic nên chỉ cần hàm lƣợng gấp 100 lần đã làm giảm pic đi 10% còn axit oxalic thì phải đến 200 lần.
Tuy nhiên việc giảm chiều cao pic không gây khó khăn cho phân tích nếu phân tích ở nồng độ 10-5M, mục đích là sóng cực phổ của Vit.C vẫn xuất hiện với chất lƣợng tốt. Hơn nữa ta thấy các axit này không chứa nhóm chức dễ bị oxi hóa nhƣ trong Vit.C. Do vậy chúng không thể hiện hoạt tính cực phổ trong khoảng thế của Vit.C. Đây chính là một trong những ƣu điểm của phương pháp phân tích cực phổ là có độ chọn lọc cao. Có thể phân tích một chất chất khi có mặt lƣợng lớn các chất khác.
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả đưa ra bởi phương pháp phân tích Vit.C bằng điện cực biến tính và điện cực sinh học.
3.1.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của ion clorua
Trong các loại thực phẩm thường chứa một lượng nhất định ion clorua.
Ion này khi có mặt ở nồng độ lớn có thể gây cản trở quy trình phân tích. Vì vậy em tiến hành khảo sát giới hạn nồng độ cho phép đối với ion clorua trong phương pháp phân tích cực phổ Vit.C. Theo tài liệu nghiên cứu thì ion clorua ảnh hưởng chủ yếu đến thế oxi hóa của giọt thủy ngân, nồng độ càng lớn thì
thế oxi hóa của thủy ngân càng chuyển về vùng âm hơn, nghĩa là chuyển dịch về phía pic của Vit.C. Đến một nồng độ nào đó, đường cực phổ của thủy ngân sẽ bao trùm lên pic của Vit.C.
Tiến hành đo đường cực phổ của Vit.C 2 mg/l, thay đổi nồng độ ion clorua theo các hàm lượng: 5, 10, 50, 100, 250, 500 mg/l tương ứng 1,4.10-
4M; 2,8.10-4M; 1,4.10-3M; 2,8.10-3M; 7.10-3M; 1,4.10-2M. Kết quả cho trong hình 3.5.
Hình 3.5: Sóng cực phổ của Vit.C khi có mặt ion clorua với nồng độ tăng dần
Nhận xét:
Khi hàm lƣợng ion clorua trong dung dịch tăng dần, giá trị thế đỉnh pic của Vit.C không thay đổi nhiều (từ -47,6mV khi không có Cl- chuyển dịch theo chiều dương đến -41,7mV khi nồng độ Cl- lớn hơn 100 mg/l) trong khi đó thế oxi hóa của thủy ngân chuyển dịch theo chiều âm, gần pic cua Vit.C hơn. Do vậy khi nồng độ của nó lớn hơn 10-2 M, mặc dù vẫn xuất hiện pic của Vit.C nhƣng máy tính không thể xác định chiều cao pic đƣợc nữa.
Có thể kết luận nồng độ ion clorua nhỏ hơn 10 M thì vẫn có khả năng phân tích Vit.C bằng cực phổ. Thêm nữa hàm lƣợng của ion clorua trong rau quả thực tế không vượt qua con số này. Trong trường hợp hàm lượng ion clorua quá lớn, phải xử lý với bạc nitrat và lọc bỏ kết tủa.
3.1.7. Độ bền của Vit.C trong các môi trường khác nhau
Vit.C là chất rất dễ bị phân hủy, nhất là trong dung dịch nên luôn luôn phải pha mẫu chuẩn theo ngày. Tuy nhiên trong 1 ngày dung dịch Vit.C cũng có thể bị phân hủy một lƣợng nhỏ. Đặc biệt là khi xử lý mẫu rau, quả, quá trình xử lý mẫu buộc phải lọc ngoài không khí, thời gian lọc có lúc kéo dài 10÷15 phút, lƣợng oxi trong không khí nằm cân bằng với dung dịch và có thể làm giảm nồng độ của Vit.C. Để giảm tối đa hiệu ứng này cần chọn dung dịch pha Vit.C, hay dung dịch dùng để chiết Vit.C trong mẫu thực tế sao cho độ bền của Vit.C trong đó là lớn nhất. Nghĩa là môi trường hòa tan oxi kém hơn, kìm hãm tốc độ oxi hóa axit ascobic.
Do quy trình phân tích cực phổ Vit.C trong nền axetat nên em chọn môi trường là dung dịch axit axetic 0,1M (pH = 2,76), dung dịch đệm axetat 0,1M (pH = 4,66) và nước. Tất cả dung dịch đều pha bằng nước cất 2 lần và đuổi oxi hòa tan trước khi pha mẫu.
Pha loãng 5 lần dung dịch Vit.C gốc bằng các dung dịch đã đƣợc đuổi oxi: a. Dung dịch axit axetic 0,1M
b. Dung dịch đệm axetat 0,1M (5:5) c. Nước cất 2 lần
Để các dung dịch vừa pha tiếp xúc với không khí. Theo dõi nồng độ Vit.C trong các dung dịch này theo thời gian, sau t phút, lấy 0,1ml từng dung dịch, đo sóng cực phổ của Vit.C trong 10ml dung dịch đệm axetat theo quy trình ghi trong bảng 2.1, ghi lại chiều cao pic sau mỗi lần đo, t = 0, 30, 60, 180, 240 phút.
Kết quả thu đƣợc trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Chiều cao pic Vit.C theo thời gian trong các môi trường khác nhau
Thời gian (phút) Vit.C 200 mg/l
Trong HAc Trong đệm Ac Trong nước
0 69,5 66,9 69,7
30 70,8 67,1 68,6
60 70,7 64,7 68,9
180 70,9 57,8 69,2
240 69,7 54,0 68,0
Nhận xét:
Từ thực nghiệm cho thấy, sau 240 phút, Vit.C trong dung dịch axit axetic và trong nước hầu như không thay đổi, mặc dù để ngoài không khí, còn trong dung dịch đệm axetat (5:5, pH = 4,7) thì chiều cao pic giảm là 5% sau 60 phút. Vì vậy pha dung dịch Vit.C gốc cũng nhƣ các dung dịch chuẩn pha loãng từ dung dịch gốc bằng nước hoặc bằng dung dịch axit axetic đã loại oxi vẫn đảm bảo độ bền trong suốt thời gian làm việc. Tuy nhiên để đơn giản em chọn dung môi nước để pha chế dung dịch chuẩn.
Trong trường hợp chiết Vit.C từ mẫu rau quả thực tế kinh nghiệm cho thấy nếu chiết trong môi trường pH thấp, thì có ưu điểm là các chất mầu, các chất hoạt động bề mặt sẽ bị kết tủa dạng keo, dung dịch chiết trong hơn, dễ lọc hơn.Vì vậy khi xử lý mẫu em dùng dung dịch axit axetic 0,1M có pH=
2,76 để chiết Vit.C, đồng thời dịch chiết chứa Vit.C thu đƣợc sẽ bền trong quá trình đo.