CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM TINH DỊCH ĐỒ
3.3.1. Đánh giá trên tiêu bản tươi
Phương pháp chuẩn bị tiêu bản tươi được thực hiện theo WHO 2021 (WHO, 2021). Trước khi tiến hành chuẩn bị tiêu bản tươi, mẫu tinh dịch cần được trộn đều bằng cách lắc nhẹ mẫu trong khoảng 15 - 30 giây. Nếu mẫu không được trộn kỹ, khi quan sát trên hai tiêu bản khác nhau sẽ nhận thấy có sự khác biệt về mật độ, tỷ lệ di
động, tỷ lệ sống cũng như hình dạng tinh trùng. Sau khi trộn đều mẫu, việc chuẩn bị hai tiêu bản lame tươi để đánh giá được thực hiện theo các bước sau đây:
❖ Nhỏ một giọt tinh dịch 10 àL đó được trộn đều lờn lame kớnh sạch.
❖ Đặt nhẹ nhàng lamelle lên giọt tinh dịch, tránh để hình thành bọt khí giữa lame và lamelle.
❖ Đợi 1 phút để tiêu bản ổn định và đánh giá lame tươi dưới kính hiển vi.
❖ Kiểm tra sự phân bố đồng đều các tinh trùng trên hai tiêu bản dưới độ phóng đại x100 (vật kính x10 và thị kính x10). Nếu tinh trùng phân bố đồng đều thì tiến hành đánh giá vi thể, nếu tinh trùng phân bố không đồng đều thì tiến hành làm lại hai tiêu bản.
❖ Chuyển sang độ phóng đại x400 để tiến hành đánh giá độ di động của tinh trùng, tỷ lệ pha loãng cần thiết để đánh giá mật độ tinh trùng, xác định sự hiện diện của các tế bào khác ngoài tinh trùng như bạch cầu hoặc tế bào dòng tinh chưa trưởng thành.
Các chỉ tiêu đánh giá:
Đánh giá tinh trùng vón cục
Tinh trùng có 2 dạng vón cục khác nhau cần đánh giá Sự kết đám:
Kết đám là tình trạng các tinh trùng không di động bị dính chặt vào nhau hoặc giữa các tinh trùng di động với chất nhầy, các tế bào không phải tinh trùng hoặc các mảnh vụn (WHO, 2021).
Hình 3.1. Sự kết đám tinh trùng
Sự kết dính:
Sự dính chặt của các tinh trùng di động với nhau theo kiểu đầu với đầu, đuôi với đuôi hoặc dính đầu với đuôi (WHO, 2021).
Hình 3.2. Sự kết dính tinh trùng Các tế bào không phải tinh trùng:
Trong mẫu xuất tinh, ngoài tinh trùng còn chứa các tế bào khác, một số loại tế bào đó có thể liên quan đến tình trạng bệnh lý lâm sàng của bệnh nhân. Tế bào biểu mô, tế bào tròn (bạch cầu hoặc tinh trùng chưa trưởng thành) được coi là các tế bào lạ có trong mẫu tinh dịch (WHO, 2021).
Đánh giá độ di động của tinh trùng (WHO, 2021):
Tỷ lệ di động di động tiến tới có liên quan đến tỷ lệ có thai. Tổng số tinh trùng di động tiến tới trong mẫu xuất tinh có giá trị ý nghĩa sinh học.
Khả năng di động của tinh trùng được phân thành bốn loại:
Di động tiến tới nhanh: tinh trùng di chuyển nhanh, theo đường thẳng hoặc thành một vũng trũn lớn, di chuyển ớt nhất 25 àm/s (hoặc bằng một nửa chiều dài đuôi) trong một giây.
Di động tiến tới chậm: tinh trùng di chuyển tích cực, tuyến tính hoặc thành một vũng trũn lớn, quóng đường di chuyển khoảng từ 5 đến 25 àm/s
Di động không tiến tới: tất cả các tinh trùng có đuôi chuyển động không tiến tới - tức là bơi trong những vũng trũn nhỏ, đầu dịch chuyển một đoạn ớt hơn 5 àm.
Bất động: không thấy đuôi chuyển động.
Cách đánh giá độ di động:
Bước 1: Tạo hai tiêu bản lame tươi. Chờ ổn định (khoảng sáu mươi giây).
Bước 2: Đếm tinh trùng cách mép lame phủ ít nhất 5 mm để tránh hiện tượng khô mẫu. Đánh giá một vi trường bất kỳ, không đợi tinh trùng bơi vào vùng đếm.
Bước 3: Đánh giá độ di động của tất cả các tinh trùng trong vi trường. Đếm có hệ thống, bắt đầu từ tinh trùng tiến tới nhanh và chậm để tránh đánh giá quá cao số lượng tinh trùng loại này. Sau đó tiến hành đếm số lượng tinh trùng không tiến tới và bất động trong vi trường. Đếm ít nhất 200 tinh trùng trong ít nhất 5 vi trường ở mỗi tiêu bản để hạn chế sai số.
Bước 4: Tính tỷ lệ (%) của bốn loại di động ở hai tiêu bản riêng biệt. Tính phần trăm trung bình và độ sai biệt giữa 2 tiêu bản để xác định khoảng chấp nhận sai số. Nếu sự khác biệt giữa các tỷ lệ phần trăm nằm trong khoảng chấp nhận được thì tiến hành ghi lại tỷ lệ phần trăm trung bình cho mỗi cấp độ di động: (a) tiến tới nhanh;
(b) tiến tới chậm; (c) không tiến tới; (d) không tiến tới. Nếu sai số cao hơn ngưỡng cho phép thì tiến hành đánh giá lại thêm một lần nữa.
Lưu ý: Tổng tỷ lệ phần trăm di động của bốn loại di động phải là 100. Nếu là 99 hoặc 101 giá trị của nhóm chiếm ưu thế được điều chỉnh để có tổng là 100. Nếu tổng < 99 hoặc > 101 phải loại bỏ lỗi đếm hoặc lỗi tính toán.
Đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng (WHO, 2021):
Tỷ lệ sống của tinh trùng được ước lượng qua tính toàn vẹn của màng tế bào và có thể được đánh giá thường quy ở tất cả các mẫu xuất tinh. Tỷ lệ tinh trùng sống được đánh giá bằng cách xác định những tinh trùng có màng tế bào còn nguyên vẹn, không bắt màu thuốc nhuộm hoặc phù nhược trương. Phương pháp được đề xuất đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng là test eosin - nigrosin.
Tỷ lệ sống của tinh trùng nên được đánh giá ngay sau ly mẫu, tốt nhất là trong vòng 30 phút và không quá 1 giờ sau xuất tinh đối với tất cả các trường hợp để hạn chế các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sức sống của tinh trùng.
Xét nghiệm sống chết bằng kỹ thuật nhuộm eosin - nigrosin, kỹ thuật này sử dụng nigrosin làm tăng độ tương phản giữa vùng nền và đầu tinh trùng, giúp chúng dễ nhận biết hơn. Nigrosin tạo ra nền tối màu, giúp quan sát dễ hơn các tinh trùng bắt màu nhạt. Dưới kính hiển vi quang học, các tinh trùng sống có phần đầu trắng, tinh trùng chết có phần đầu màu đỏ hoặc hồng. Tinh trùng có đầu màu hồng nhạt được đánh giá là tinh trùng chết. Nếu tinh trùng chỉ bắt màu thuốc nhuộm ở phần cổ, phần còn lại vẫn sáng thì tinh trùng được coi là “rò màng bào tương cổ”, không có dấu hiệu của tế bào chết hay phân rã màng hoàng toàn. Những tế bào này nên được đánh giá là sống.
Quy trình xác định sống chết bằng kỹ thuật nhuộm eosin - nigrosin Bước 1: Trộn đều mẫu tinh dịch.
Bước 2: Lấy 50 àl tinh dịch đó ly giải trộn đều với thể tớch tương đương hỗn hợp hóa chất nhuộm eosin - nigrosin.
Bước 3: Phết mẫu lên lame kính và để khô trong không khí.
Lưu ý: Đánh giá mẫu ngay sau khi khô hoặc sau khi xử lý với mô trường cố định mẫu không chứa nước.
Bước 4: Đánh giá tiêu bản dưới độ phóng đại x1000 của kính hiển vi quang học có phủ dầu. Đếm số lượng tế bào tinh trùng chết (bắt màu) và tế bào tinh trùng sống (không bắt màu). Đếm tối thiểu 200 tinh trùng để đạt tới sai số lấy mẫu thấp chấp nhận được.