Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu mô mỡ và phân lập tế bào
Mô mỡ dưới da được lấy vô trùng từ phòng mổ sẽ được bảo quản ngay trong môi trường phù hợp, giữ ở 40C và chuyển về labo. Môi trường bảo quản mô mỡ bao gồm D’MEM cú 500U/ml penicillin, 500àg/ml streptomycin và amphotericin B.
Sau đó, mô mỡ được xử lý và phân lập tế bào gốc tại labo nuôi cấy tế bào với quy trình như sau:
- Rửa mô mỡ 3 lần bằng PBS để loại bỏ các cấu trúc không thuộc mô mỡ. Sau đó, mô mỡ được đặt trong đĩa petri vô trùng có sẵn D’MEM và 5% kháng sinh, kháng nấm rồi được cắt thành các mẩu rất nhỏ.
- Bổ sung Collagenase vào đĩa có chứa mô mỡ cho tới nồng độ cuối cùng là 0,075%.
- Đặt tube hỗn dịch trên vào tủ ấm khoảng 30 phút, lắc đều với lực vừa sau mỗi 10 phút
- Bổ sung FBS sau 30 phút để bất hoạt enzyme Collagenase
- Ly tâm tốc độ 1500 rpm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và thu tế bào.
- Đếm số lượng tế bào thu được trong buồng đếm Neubeur để xác định nồng độ tế bào có trong hỗn dịch thu được.
- Cấy vào đĩa petri d=100mm sao cho đạt số lượng khoảng 20.000 tế bào/cm2 bề mặt nuôi cấy.
- Bổ sung 8 – 10ml môi trường D’MEM có chứa có 100U/ml penicillin, 100àg/ml streptomycin và 10% FBS
- Đặt đĩa vào tủ nuôi, nhiệt độ CO2, 370C và 5% CO2
- Sau 48h tiến hành hút dịch nổi bao gồm môi trường nuôi cấy và các tế bào không phải là tế bào gốc trung mô cùng các tế bào chết, rửa bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch PBS để loại bỏ các phân tử mỡ còn sót lại.
- Quan sát tế bào và tiến hành thu tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin khi mật độ tế bào đạt 80% diện tích che phủ.
- Các tế bào thu được sau đó được đếm xác định số lượng. Sau đó, bảo quản lạnh sâu hoặc cấy trở lại đĩa nuôi với mật độ 5000 TB/cm2 cho tới thế hệ thứ 5 để cung cấp cho nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào ASCs
- Kiểm tra cẩn thận tình trạng tế bào nuôi cấy để phát hiện các dấu hiệu nhiễm khuẩn và mycoplasma, khi độ che phủ của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy đạt ít nhất khoảng 70% thì tiến hành cấy truyền
- Hút bỏ dịch nổi trong đĩa nuôi cấy rồi đem rửa tế bào bằng dung dịch đệm PBS
- Bổ sung dung dịch Trypsin/EDTA 1x với thể tích 0,1ml/cm2, đặt đĩa nuôi cấy vào tủ ấm với điều kiện nhiệt độ 370C, 5% trong 5 phút. Sau đó, bất hoạt trypsin bằng 0,1 ml/cm2 môi trường nuôi cấy, thu tế bào và đếm số lượng tế bào.
- Ly tâm ở tốc độ 1600 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm và bổ sung mụi trường nuụi cấy D’MEM cú chứa cú 100U/ml penicillin, 100àg/ml streptomycin và 10% FBS.
- Khối tế bào thu được cấy truyền sang đĩa khác để tiếp tục nuôi cấy hoặc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Xác định số lượng tế bào
Xác định được số lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy sẽ đánh giá được khả năng nhân lên của tế bào. Phương pháp để xác định số lượng tế bào là sử dụng buồng đếm Neubauer. Để xác định tỷ lệ sống – chết của tế bào, tế bào được nhuộm với Trypan – blue, tế bào chết sẽ bắt màu với thuốc nhuộm này còn tế bào sống thì ngược lại. Sau khi tế bào đã được xử lý với Trypsin/EDTA 1x, trộn 1ml hỗn dịch tế bào với chất nhuộm màu Trypan-blue theo tỷ lệ 1:1. Hút hỗn dịch tế bào và chất nhuộm màu bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm để hỗn dịch tự chảy vào buồng đếm. Số lượng tế bào được đếm dưới kính hiển vi trên đơn vị diện tích 1mm2.
Công thức tính số lượng tế bào như sau:
C = n/v
n: số lượng TB đã đếm được trong buồng đếm v: thể tích đếm (ml)
C: mật độ tế bào (TB/ml).
Buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm3 = 1.10-4 ml. Do đó, công thức tính số lượng tế bào là:
C = n x 104/ml 2.2.4. Bảo quản và phục hồi tế bào sau bảo quản
Các tế bào thu được chưa được sử dụng hay trong thời gian chờ các thí nghiệm khác nhau sẽ được bảo quản để duy trì tính ổn định của tế bào. Phương pháp bảo quản và phục hồi tế bào sau bảo quản được tóm tắt như sau:
Bảo quản tế bào
- Kiểm tra tế bào nuôi cấy trong đĩa nuôi, đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào, kiểm tra tình trạng nhiễm trùng. Tách tế bào trong chai nuôi bằng cách sử dụng Trypsin và đếm số lượng tế bào
- Pha dung dịch bảo quản lạnh sâu theo công thức:
+ Môi trường bảo quản tế bào gốc trung mô gồm 5% DMSO và 95% môi trường D’MEM
- Pha hỗn dịch tế bào thu được sau khi tách vào dung dịch bảo quản ở nồng độ 1x106 tế bào/ ml
- Chuyển hỗn dịch vào các ống bảo quản lạnh sâu
- Đặt các ống tế bào vào các hộp bảo quản, ghi lại các thông số: loại tế bào, số thế hệ tế bào, ngày bảo quản lạnh sâu. Đặt hộp vào tủ lạnh – 80°C, nhiệt độ trong hộp sẽ từ từ hạ xuống với tốc độ 1oC/ phút. Sau khoảng 2-4 giờ, nhiệt độ trong hộp ổn định ở – 80oC thì chuyển sang bình nitơ lỏng để bảo quản lâu dài.
Phục hồi tế bào
- Kiểm tra thông số ghi trên ống bảo quản và lựa chọn lô tế bào phù hợp với yêu cầu
- Nhanh chóng đặt ống tế bào vào bể ổn nhiệt 37oC cho tới khi hỗn dịch trong ống tế bào rã đông hoàn toàn
- Khử trùng ống tế bào với cồn 70% và đưa vào tủ cấy - Chuyển tế bào từ ống sang chai nuôi cấy
- Từ từ bổ sung môi trường nuôi cấy vào hỗn dịch tế bào ở tốc độ khoảng 5ml/
phút
- Lấy lượng nhỏ tế bào đã pha loãng để đánh giá tỷ lệ sống/ chết của tế bào sau khi được bảo quản
- Cấy tế bào trở lại chai nuôi cấy để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo 2.2.5. Xác định đặc điểm hình thái tế bào trong nuôi cấy tăng sinh
Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong nuôi cấy có tính bám dính thành lớp đơn trên bề mặt đĩa và có hình dạng thuôn dài và có các nhánh tế bào chất giống nguyên bào sợi. Đặc điểm hình thái tế bào được đánh giá qua kính hiển vi.
2.2.6. Xác định khả năng tạo dòng của tế bào
Để xác định tính gốc của tế bào thông qua khả năng tự đổi mới của chúng, hỗn dịch các tế bào đơn lẻ được chuẩn bị và cấy trong đĩa nuôi cấy đường kính 60 mm ở mật độ 50 tế bào/ cm2. Đĩa nuôi cấy sau đó được duy trì ở điều kiện nuôi cấy trong thời gian 2 - 3 tuần để theo dõi sự hình thành và phát triển của các quần lạc tế bào (colony). Đĩa tế bào nuôi cấy sau đó được cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa. Một nhóm tế bào được xác định là đơn colony khi nó có ít nhất 50 tế bào.
Khả năng tạo colony được tính toán dựa trên tỷ lệ % số colony đạt được so với số tế bào được cấy. Các bước tiến hành tạo dòng như sau:
- Cấy tế bào thí nghiệm trong đĩa nuôi cấy có đường kính 60mm với mật độ 50 tế bào/ cm2, mỗi đĩa cho 4mm môi trường nuôi cấy, thay môi trường sau mỗi 3 ngày
- Theo dõi sự tạo thành colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về:
+ Colony đã hình thành chưa?
+ Mỗi colony có mấy tế bào?
+ Hình thái tế bào?
- Nhuộm giemsa sau 3 tuần
- Tính tỷ lệ phần trăm số colony/ số tế bào được cấy, mỗi colony khi đó được xác định là có trên 50 tế bào
2.2.7. Lập kiểu nhân của tế bào
Phương pháp làm tiêu bản được dùng trong nghiên cứu này phương pháp lập band G với việc sử dụng colchicine đối với tế bào nuôi cấy. Việc lập kiểu nhân được thực hiện tại Trung tâm tư vấn di truyền – Bệnh viện Đại học Y Hà Nội với quy trình như sau:
- Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được nuôi cấy đến P5
- Trước khi thu hoạch 2 giờ (giờ thứ 70), bổ sung Colcemid cho tới nồng độ 0,1 à/ml
- Ly tâm ống nuôi cấy tế bào với vận tốc từ 800 – 1000 vòng/phút/10 phút.
Dùng pipet hút dịch nổi ở phía trên và giữ lại phần cặn tế bào
- Bổ sung 10ml dung dịch nhược trương KCl 0.075M vào ống đựng cặn tế bào và để trong tủ ấm 37°C trong 30 phút.
- Ly tâm ống đựng dung dịch tế bào ở tốc độ 800 – 1000 vòng/phút/10 phút.
Dùng pipet hút dịch nổi phía trên và giữ lại cặn tế bào.
- Dùng pipet Pasteur nhỏ từ từ từng giọt dung dịch carnoy (3 methanol : 1 acid acetic) với lượng 2ml để cố định NST và lắc nhẹ, sau đó bổ sung 8-10ml dung dịch carnoy, đậy nắp và để ở trong thời gian khoảng 30 phút 37°C trong 30 phút.
- Ly tâm lần 2, loại bỏ dịch nổi và giữ lại phần cặn tế bào rồi cho khoảng 8ml dung dịch carnoy.
- Ly tâm lần 3, loại bỏ dịch nổi và giữ cặn tế bào. Tiếp đó, dùng pipet Pasteur trộn đều hỗn dịch tế bào.
- Làm tiêu bản: chuẩn bị lam kính sạch, nhỏ 1- 2 giọt hỗn dịch tế bào lên phần giữa của lam kính rồi hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn hoặc trên bản nóng 37°C.
Để tiêu bản khô và nhuộm tiêu bản với giemsa theo tỷ lệ 20% thời gian khoảng 30 phút hoặc giemsa 5% trong dung dịch đệm photphat trong khoảng 15 phút.
2.2.8. Tách chiết và định lượng enzyme telomerase của tế bào sau nuôi cấy tăng sinh
Tách chiết enzyme telomerase
- Ly tâm ở tốc đô ̣ thấp trong 5 phút để thu tế bào. Loại bỏ dung dịch nuôi cấy - Rửa la ̣i đĩa nuôi cấy bằng PBS, ly tâm la ̣i, cẩn thâ ̣n loa ̣i bỏ phần di ̣ch nổi - Hòa tan phần cặn tế bào với 1ml dung di ̣ch RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer) lạnh đã được bổ sung yếu tố ức chế enzyme protease hoă ̣c /và enzyme phosphatase . Nhẹ nhàng tr ộn dung di ̣ch trên với dung di ̣ch RIPA rồi ủ trên đá trong 30 phút
- Ly tâm la ̣nh 10000 v/phút trong 10 phút. Phần di ̣ch nổi chính là phần tế bào đươ ̣c ly giải toàn phần, loại bỏ phần cặn và chuyển toàn bộ dịch nổi sang ống mới.
Định lượng enzyme telomerase
Việc định lượng enzyme telomerase được thực hiện dựa trên phương pháp Sandwich – ELISA theo các bước như được hướng dẫn trong bộ ELISA kit của nhà sản xuất. Về nguyên lý, các giếng đã được tráng sẵn kháng thể đặc hiệu với enzyme telomerase. Sau khi bổ sung mẫu nghiên cứu vào giếng, chúng sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu này. Sau đó, Horseradish Peroxidase (HRP) liên kết đặc hiệu với enzyme telomerase được bổ sung vào các giếng và ủ. Các thành phần không kết hợp được rửa sạch. Dung dịch cơ chất TMB (Tetramethylbenzidine) được bổ sung vào các giếng để tạo ra tín hiệu phát quang. Chỉ có những giếng có chứa enzyme telomerase và enzyme telomerase liên kết HRP mới có màu xanh và sau đó chuyển sang màu vàng sau khi bổ sung dung dịch ngừng phản ứng (HCl). Chỉ số OD được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 450 nm. Giá trị OD tỷ lệ thuận với nồng độ của enzyme telomerase. Nồng độ enzyme telomerase ở mỗi mẫu được tính bằng cách so sánh giá trị OD của mẫu với giá trị OD chuẩn.
2.2.9. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến nguyên bào sợi in vitro
Trước đây, quy trình các bước thí nghiệm đánh giá tác động của tấm tế bào gốc trung mô từ mô mỡ của người khỏe mạnh đến nguyên bào sợi và tế bào sừng đã được hoàn thiện tại Viện Bỏng Quốc gia vào năm 2014 [2]. Trên cơ sở kế thừa thành quả nghiên cứu đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đồng nuôi cấy giữa ASCs của bệnh nhân có vết thương mạn tính và nguyên bào sợi và theo dõi ảnh hưởng của ASCs thế hệ P5 lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi, qua đó có thể đánh giá một phần tác động của chúng đối với quá trình lành vết thương mạn tính.
Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×104 TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô bao gồm D’MEM 1% được bổ sung FBS và 1%AB.
Nguyên bào sợi được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh.
Tế bào ASCs của bệnh nhân ở P5 được cấy trên insert với mật độ 5000 TB/cm2 và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 11 ngày trước khi đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi, khi đó ASCs đạt 70-80% độ che phủ và vẫn ở tình trạng chưa biệt hóa.
Tấm tế bào gốc trung mô chứa cả insert sau đó được đặt vào các giếng nguyên bào sợi và bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy MSCs mới.
Thí nghiệm đối chứng gồm:
1. Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào.
2. Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert là ASCs của người khỏe mạnh, được cấy ở mật độ 5x103 TB/insert và duy trì trong môi trường tăng sinh MSCs trong 6 ngày trước khi đồng nuôi cấy.
Tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, các giếng nguyên bào sợi được xử lý với trypsin và đếm số lượng tế bào cũng như xác định tỷ lệ sống/chết của tế bào thu được.
2.2.10. Theo dõi bệnh nhân có vết thương mạn tính được ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
Việc sử dụng hỗn dịch tế bào gốc trung mô để bôi lên vết thương nhằm kích thích sự tái tạo làm liền vết thương đã được thực hiện ở nhiều nghiên cứu trên thế giới. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của PGS.TS.BS Đinh Văn Hân đã bước đầu ứng dụng tế bào gốc trung mô trên lâm sàng trên cơ sở đã xây dựng và hoàn thiện quy trình tạo tấm tế bào gốc mỡ với các tiêu chuẩn sau:
- Tấm tế bào có chứa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được nuôi cấy tới P3-P5 - Tế bào còn khả năng phân chia
- Hình thái tế bào gốc mỡ và nhân bình thường
- Giỏ đỡ tế bào là màng Polycarbonate cú kớch thước lỗ đạt trờn 3 àm - Mật độ tế bào gốc mỡ đạt trên 5x104 TB/cm2
- Độ che phủ tế bào gốc mỡ đạt trên 90%
- Tấm tế bào gốc mỡ vô khuẩn, vô nấm, âm tính với Mycoplasma - Xét nghiệm karyotype của tế bào gốc mỡ bình thường
- Nồng độ enzyme telomerase tế bào gốc mỡ ở ngưỡng tương đương với tế bào soma bình thường
Sau khi có tấm tế bào gốc mỡ có đạt các tiêu chuẩn cấy ghép được ghép trên một số bệnh nhân. Trong khuôn khổ nội dung luận văn này, chúng tôi tiến hành theo dõi một ca điều trị ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trên bệnh nhân Đinh Văn Xuân, giới tính nam, 60 tuổi số bệnh án 2842 với chẩn đoán loét 46 cm2 hai bên cẳng chân do nhiễm khuẩn mô mềm ở tháng thứ 5. Các thời điểm nghiên cứu, đánh giá vết thương bao gồm:
- T1: Ngay trước khi ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ - T2: Sau khi ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 7 ngày - T3: Sau khi ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 15 ngày - T4: Sau khi ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 20 ngày
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: xét nghiệm sinh hóa máu, lượng dịch tiết tại vết thương, tình trạng nhiễm khuẩn, tình trạng biểu mô hóa, diện tích vết thương,…
Các số liệu thu được trong quá trình nghiên cứu được quản lý và xử lý bằng các phương pháp thống kê và kiểm định giả thiết thống kê thông qua sử dụng phần mềm Stata 12.
Chương 3